春夏两季浓香型白酒糟醅中四大有机酸的变化及其对酒质的影响

张　方，邓　波，张宿义，苏占元，宋　川，敖宗华（.四川理工学院生物工程学院，四川自贡63000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州66000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州66000；.国家酒类及加工食品质量监督检验中心泸州实验室，四川泸州66000）



春夏两季浓香型白酒糟醅中四大有机酸的变化及其对酒质的影响

张方1，邓波2，3，张宿义2，3，苏占元4，宋川2，3，敖宗华2，3
（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000；4.国家酒类及加工食品质量监督检验中心泸州实验室，四川泸州646000）

摘要：采用气相色谱法和对羟基联苯比色法，通过连续跟踪春夏两季浓香型白酒糟醅中四大有机酸（己酸、乙酸、乳酸及丁酸）的变化，并对春夏两季所产白酒酒样进行理化分析和感官尝评，从而判断出发酵过程中四大酸与白酒酒质的关系。结果表明，除了乳酸，其他3种有机酸的含量均为春季大于夏季的。春季的酒质优于夏季，且其中己酸乙酯的含量明显高于夏季。

关键词：浓香型白酒；糟醅；有机酸；白酒

在浓香型白酒中，酯类、酸类、醇类、醛等微量成分虽只占总量的2%，但是其量比关系却决定着白酒的品质及口感。其中有机酸是浓香型白酒的重要呈味物质之一，它的绝对含量在微量成分中仅次于酯类，约为总酯含量的1/4［1］。在白酒发酵过程中，酒醅中的酸度变化影响着酒醅中微生物的生长代谢，同时，有机酸作为相应酯类的前体物质，其种类、含量和比例都直接影响着发酵生成酯类的多少。因此，在浓香型白酒的发酵过程中，有机酸对酒醅发酵和白酒品质都有着较大影响［2-3］。前人对白酒中的香味成分作了大量的研究，而对糟醅中有机酸的研究还甚少，尤其是不同季节对于浓香型白酒糟醅中有机酸变化的影响研究还几乎处于空白状态［4-5］。本研究通过跟踪春夏两季浓香型白酒中四大有机酸的变化，并对白酒酒样进行理化分析和感官尝评，探索有机酸对白酒酒质的影响。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

糟醅及酒样：取自四川省某名酒厂。

仪器设备：DHG-9123A电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），BSA822-CW感量天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），100 mL瓷蒸发皿，DL-1万用电炉（北京中兴伟业仪器有限公司），酸碱滴定仪器，7890N气相色谱仪（U.S. Agileat Technologies），紫外可见分光光度计UV1600 PC（上海美普达仪器有限公司），数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

试剂：无水乙醇，己酸，乙酸，丁酸，己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯，丁酸乙酯，无水乳酸锂，对羟基联苯，钨酸钠，硫酸铜，氢氧化钙，浓硫酸等均为分析纯试剂；乙酸正戊酯，乙酸正丁酯，以上试剂为色谱纯。

1.2实验方法

1.2.1糟醅中有机酸的提取

称取酒醅样品5 g，加入60%的乙醇溶液，搅拌均匀后在25℃下超声波振荡浸提60 min后，将浸提液以12000 r/min离心10 min，然后用0.45 μm滤膜过滤，制成有机酸提取液。

1.2.2有机酸等微量成分的测定

色谱条件：毛细管柱为LZP-930B白酒分析专用柱（18 m×0.53 mm×1.0 um）；载体为Chromosorb W（AW），80～100目；固定液为20%DNP加7%吐温80；载气（高纯氮）；流速为0.5～1.0 mL/min，分流比约为37∶1，尾吹气为20～30 mL/min；氢气流速为40 mL/min；空气流速为400 mL/min；检测器和注样器的温度均为220℃；柱温的起始温度为60℃，恒温6～8 min，以5℃/min程序升温至220℃，继续恒温10 min。

1.2.3对羟基联苯法测定乳酸［8-9］

样品的处理：将有机酸提取液稀释后，吸取2 mL稀释液并加入2 mL钨酸溶液混匀静置至溶液出现明显絮状物，10000 r/min离心10 min后取上清液，并将上清液置于60℃水浴中保温30 min，冷却待用。

标准曲线的制作：用200 μg/mL乳酸标准液同有机酸提取液预处理后，配置成0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的不同梯度的乳酸标准溶液。取上述标液分别加50 mg氢氧化钙粉末和20%的硫酸铜溶液混匀后沸水浴3 min，冷却后3000 r/min离心5 min。取上清液0.5 mL加入6 mL浓硫酸混匀后沸水浴5 min迅速冷却，将0.125 mL对羟基联苯溶液加入其中混匀静置15 min，沸水浴5 min再冷却待测，使用紫外分光光度计测定在波长565 nm处的吸光度值。乳酸含量的测定参照参考文献［9］的方法测定。

1.2.4糟醅中酸度的测定［2］

酸度：参照参考文献［2］的方法测定。

2结果与分析

2.1乳酸标准曲线及春夏两季糟醅发酵过程中乳酸的变化

2.1.1乳酸标准曲线的制作

乳酸标准曲线见图1。

图1　乳酸标准曲线

由图1可知，根据1.2.3中方法做出乳酸的标准曲线方程为：

y=0.0136x-0.1175（R2=0.9928）。

其中：y为吸光度；x为乳酸标液浓度（μg/mL）。

2.1.2春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中乳酸的变化

乳酸是浓香型白酒中四大有机酸之一，是构成白酒风味的主要物质。在浓香型白酒发酵过程中如果乳酸的量比适当，它不但对入窖酸度的调节有一定作用，还能够抑制细菌的过早、过度增长［10］。通过跟踪糟醅发酵过程中的乳酸的变化规律，能够反映出微生物的代谢情况。糟醅发酵过程中乳酸变化见图2。

图2　春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中乳酸的变化

结合1.2.3的测定方法和图1的标准曲线测得春夏两季发酵糟醅中的乳酸，由图2可知，春夏两季的变化趋势大体一致，在15 d左右上升到第一个峰值，中间有小幅度的波动，30～40 d时到最高点后缓慢下降最后趋于平稳。在发酵前期，窖池中氧气充足，微生物数量快速增加且酵母菌占主导地位；15 d左右时，乳酸含量有小幅度下降，这可能是由于发酵前期窖池中的微生物消耗了大量的氧气、氮源、碳源等物质，此时能源处于供给不足状态，乳酸作为反应物被消耗利用，并且部分乳酸酯化反应生成乳酸乙酯使得同时期窖池中的乳酸乙酯含量明显的增高；当糟醅发酵到中后期（30～40 d）时氧气已被大量消耗，此时发酵由细菌（乳酸菌、毛霉菌、根霉菌）等主导，这些细菌发生厌氧反应生成大量的乳酸，故此时乳酸的含量达到最高点，春季为14.732 mg/g，夏季则高达16.638 mg/g；在40 d后主要为产酯期，乳酸和相应的乙醇发生酯化反应生成大量的乳酸乙酯，故此时的乳酸含量处于比较平稳的时期。总体上，春季白酒糟醅中乳酸含量都要低于夏季，主要是因为夏季比春季的温度和入窖酸度高，入窖温度高，不利于酵母菌充分发酵而致其过快衰亡［11］，细菌占主导地位时间过长，乳酸含量过高。

2.2春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中乙酸的变化

在浓香型白酒中，乙酸是仅次于己酸的一种重要有机酸。白酒发酵期间，乙酸即伴随着酒精产生，它是酒精发酵不可避免的产物，同时还是丁酸、己酸、乙酸乙酯的前体物质，故乙酸在白酒发酵中占有很重要的地位［3］。糟醅发酵过程中乙酸的变化见图3。

图3　浓香型白酒糟醅发酵过程中乙酸的变化

由图3可知，乙酸伴随着酒精的生成同时出现，糟醅中乙酸含量在发酵初期缓慢增长，在15 d左右达到第1个峰值，这主要是因为醋酸菌作为生成乙酸的主要菌种在发酵前期有充足的能源和氧气供其生长代谢，此时它作为优势菌种繁殖并产生乙酸，同时部分酵母菌在无氧呼吸的条件下生成酒精的同时还伴随着乙酸的生成，春季较夏季更快产生酒精且春季的入窖温度和酸度都比夏季更适合醋酸菌的生长，所以，春季入窖后初期糟醅中乙酸含量要比夏季更早达到第1个峰值。当到达发酵中后期（产酸期）时，春夏两季的糟醅中乙酸达到第2个峰值，但春季糟醅中乙酸的含量明显低于夏季，这可能是因为此时虽然醋酸菌大量死亡，但酒醅中已生成大量酒精，部分乙醇氧化生成乙醛后发生歧化作用再生成乙酸，而夏季温度较高，大量厌氧型微生物生长旺盛代谢产生乙酸，夏季糟醅中乙酸乙酯含量明显升高且多于春季糟醅［12］，所以在发酵后期，春季糟醅中乙酸含量低于夏季。

2.3春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中己酸的变化

己酸作为己酸乙酯的前体物质，同时也是白酒中一种重要的呈香呈味物质。据报道［13］，己酸含量的适当增加对于己酸乙酯的水解有一定的抑制作用，在发酵过程中己酸的含量决定着白酒中己酸乙酯的含量，故跟踪白酒发酵过程中己酸的含量对白酒生产有一定的指导作用。糟醅发酵过程中己酸的变化见图4。

图4　春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中己酸的变化

由图4可知，在春夏两季糟醅发酵过程中，糟醅中己酸含量在10～20 d之间达到第1个小高峰，春季的峰值为0.0442 mg/g，而夏季的峰值仅为0.0179 mg/g。随后又有一个大幅度的下降，在白酒发酵中后期（产酸期），己酸含量达到第2个峰值，此时窖池中的氧气被好氧微生物大量消耗并衰亡，己酸菌（也叫科拉瓦氏梭菌）等兼性厌氧型细菌此时处于较为活跃的状态，它将酒精和乙酸经过一系列的缩合还原以及水解反应合成为丁酸和己酸，此时若糟醅中的乙醇多于乙酸时，它的主要产物为己酸。春季在35 d时糟醅中己酸含量为0.0555 mg/g，明显大于夏季。这可能是由于夏季糟醅发酵过程中乳酸的含量偏高，对己酸菌等有益的微生物有一定的抑制作用，从而导致夏季糟醅中己酸含量降低［14］。后期由于己酸与酒精通过酰基辅酶A反应生成己酸乙酯，同时己酸菌也可以利用乙酸乙酯为承受体生成己酸乙酯，从而造成糟醅中己酸的消耗减少和己酸乙酯含量的增加。

2.4春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中丁酸的变化

丁酸是浓香型白酒中四大最主要有机酸中含量最低的一种，占总酸的9%。丁酸含量虽低，然而它作为发酵过程中许多香味物质的中间物质和丁酸乙酯的前体物对白酒发酵过程有着重要的影响［1］。白酒糟醅发酵过程中丁酸的变化见图5。

由图5可知，春夏两季糟醅入窖时丁酸含量几乎一致，前10 d的变化较为平缓，在10～20 d时丁酸含量出现第1个峰值，春季达到了0.0667 mg/g，而夏季低于春季，仅为0.0504 mg/g。当发酵进入中后期时，窖池中的微生物大部分开始进行无氧呼吸，丁酸菌、异型乳酸菌、己酸菌等细菌处于活跃状态，其中丁酸菌利用糟醅中的糖类、氨基酸、乙酸和酒精等生成丁酸，还能够利用乳酸代谢生成丁酸，部分己酸菌还能够利用乙醇和乙酸形成丁酸，所以此时糟醅中的丁酸富集达到最高点［12］。在发酵后期，丁酸菌大量死亡且丁酸又作为底物被其他微生物消耗转化为丁酸乙酯、己酸等其他产物而大幅度减少。春季由于同一时间点的酸度低于夏季，乳酸菌对丁酸菌的抑制作用较低，故春季糟醅中丁酸含量要高于夏季。

图5　春夏两季浓香型白酒发酵糟醅中丁酸含量的变化

2.5春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中酸度的变化

浓香型白酒发酵过程中酸度变化主要是由糟醅中的有机酸含量的改变所引起的，所以跟踪白酒发酵过程中酸度的变化可以反映有机酸总含量的变化趋势，并对研究白酒中四大有机酸的变化有着指导作用。糟醅发酵过程中酸度的变化见图6。

图6　浓香型白酒糟醅发酵过程中酸度的变化

由图6可知，春夏两季发酵糟醅中的酸度随着时间的变化而呈上升趋势，在出窖时会有小幅度下降。这是由于在整个发酵过程中，窖池中微生物的生长代谢造成了有机酸总量不断增长，出窖前采取的滴窖等降酸措施造成后期酸度下降。0～10 d时，酵母菌的生长繁殖占有优势，以产酒精为主，导致酸度增长较为缓慢；在35 d左右，酸度达到最大，并且夏季的酸度要大于春季。这一方面是因为夏季的入窖糟醅中的酸度比春季的高［2］，另一方面是夏季的温度更有利于细菌等微生物的繁殖代谢，酵母菌产酒精的时间明显比春季短的同时更早进入产酸期。

2.6春夏两季浓香型白酒糟醅中四大酯含量的变化

浓香型白酒中，酯类含量约占香味成分总量的60%，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯在浓香型酯类组分含量中占90%～95%，其中己酸乙酯是浓香型白酒的主体香气成分，在一定浓度范围内决定着浓香型白酒品质的优劣，同时，白酒中的其他酯类与己酸乙酯含量的比例关系也影响着白酒的酒体风格。春夏两季浓香型白酒糟醅发酵过程中四大酯含量的变化见表1。

表1显示出在整个发酵过程中，酯类的含量一直处于逐渐上升的状态，在25 d以后增长速度加快，这主要是发酵前期以碳源、氮源、酯类物质消耗代谢为主，到发酵后期，氧气消耗殆尽以及代谢产物大量积累，此时厌氧和兼性厌氧型细菌处于主导地位，它们产生大量的酸类、醛类、酯类等次级代谢产物，这些有机酸类物质在酯化酶和酰基辅酶A的作用下乙酯化合成其相应的酯类物质，从而造成酒糟中酯类的富集。由表1还可看出，春季发酵糟醅中己酸含量高于夏季，相应的春季酒糟中己酸乙酯含量也明显较夏季要多，但是乳酸和乳酸乙酯的含量较夏季的少，春季发酵糟醅中乙酸和乙酸乙酯含量的增长较为平缓，而夏季在发酵后期，乙酸和乙酸乙酯的含量增长较快，这不利于发酵过程中酒精的生成；春季糟醅中丁酸和丁酸乙酯的含量也高于春季。

2.7酒样分析

2.7.1酒样的理化分析

当整个发酵周期结束后，车间小组工作人员将出窖糟醅进行蒸馏流酒并分段摘酒，取二段综合样进行气相色谱分析得酒样中的香味成分含量，结果见表2。

由表2可知，春季酒样中的己酸和己酸乙酯含量明显高于夏季，而乳酸和乳酸乙酯含量低于夏季，各香味成分之间的量比关系也要优于夏季。这一结果与发酵过程中酸类和对应酯类的变化趋势一致。

表1　春夏两季浓香型白酒糟醅中四大酯含量的变化　（mg/g）

表2　春夏两季二段综合酒样中香味成分含量（g/L，折算成60%vol）

2.7.2出酒率及酒样的感官评价

按照实验的安排，实验窖池发酵完成后蒸酒，采用分段摘酒的方式对酒样进行计重并测量酒精度，将记录数值折算为20℃、60%vol时的重量来计算出酒率。出酒率=产酒总量/粮食总量×100%。酒样的尝评是邀请包括国家级白酒品酒委员在内的专业品酒组对所取酒样进行品评和打分的过程。鉴定结果见表3。

表3　出酒率及酒样的感官评价

由表3可看出，夏季的出酒率比春季略高，然而口感比春季稍差，糟香和窖香不如春季突出。这主要是由于夏季的入窖温度过高且入窖酸度也偏高，这种环境不利于酵母菌的生长繁殖，反而更有利于杂菌的滋生繁衍，产生一些不利于发酵生产和白酒品质的次级代谢产物（如正丁醇、糠醛、丙烯醛等），这些物质会导致基酒涩杂等不正常的口感。

3　结论

本研究，通过对比春夏两季发酵糟醅中4种有机酸的变化规律，发现除了乳酸外其他3种有机酸的含量均是春季大于夏季。在整个发酵周期内，除30～40 d时有机酸的变化有一个较为明显的波峰，4种有机酸的变化趋势大体上与酸度的变化一致。在30～40 d之间，细菌等微生物的繁殖代谢不仅生成了酸类物质，同时还进行着酯化、水解等一系列复杂的生化反应，所以，虽然某一种有机酸的含量增长，但酸类物质的总量并未增长太多，且浓香型白酒发酵糟醅中四大有机酸的含量大小排列为乳酸＞乙酸＞己酸＞丁酸，这一方面是由于泸型酒主要采用续糟发酵工艺，乳酸等不挥发性物质随着母糟带入到酒糟中；另一方面是因为窖池是一个偏酸性的环境，更有利于乳酸菌的生长代谢而生成更多的乳酸。

在蒸馏的基酒酒样中，乳酸的含量并没有明显的大于乙酸。这可能是由于这两种有机酸的沸点接近，乙酸的沸点更高更易液化析出。通过酒样的理化分析和感官尝评打分发现，夏季的整个发酵过程中，酸度和乳酸的含量高于春季，而夏季的酒样的感官评价较差，其中己酸乙酯含量偏低而乳酸乙酯含量较高，这一现象进一步证明了生产过程中乳酸和乳酸乙酯的适当减少有利于己酸乙酯含量的提高，同时也为“增己、降乳”这一理论提供了科学的论据。

总之，本实验结合生产实际考察浓香型白酒发酵糟醅中四大有机酸的变化规律及相应酒样的品质，进一步验证酸对于白酒生产的影响及其与白酒品质的联系，故在车间生产期间应结合实际情况，适当改进发酵环境、生产工艺和工人操作等，如窖泥养护、滴窖、缓慢上甑、缓火蒸馏、夏季减少投糠量等措施来达到降低酸度的同时达到“增己降乳”的作用。

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中图分类号：TS262.3；TS261.7；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0070-05

基金项目：四川省科技支撑项目《基于风味指纹图谱的微生物强化共培技术研究及应用》（2014SZ0129）。

收稿日期：2016-02-26

作者简介：张方（1988-），女，硕士研究生，研究方向：酿酒生物技术。

通讯作者：张宿义（1971-），男，博士，硕士生导师，国家级白酒评委，中国酿酒大师，享受国务院特殊津贴专家，发表论文100余篇，获授权专利78项。优先数字出版时间：2016-04-01；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160401.1342.005.html。

DOI：10.13746/j.njkj.2016056

The Changes of Four Main Organic Acids in Fermented Grains of Nongxiang Baijiu in Spring and in Summer and Their Effects on Liquor Quality

ZHANG Fang1，DENG Bo2，3，ZHANG Suyi2，3，SU Zhanyuan4，SONG Chuan2，3and AO Zonghua2，3
（1. College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong，Sichuan 643000；2. Luzhou Laojiao Co. Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；3. National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Luzhou，Sichuan 646000；4. Luzhou Lab of National Quality Inspection & Supervision Center for Alcoholic Drinks & Processed Food，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Abstract：The relationships between four main organic acids and liquor quality in fermentation process were analyzed through continuous tracing measurement of the changes of four organic acids（caproic acid，acetic acid，lactic acid and butyric acid）in spring and in summer by GC and p-hydroxydiphenyl colorimetry and physiochemical analysis and sensory assessment of the produced liquor samples. The results showed that，the content of the three organic acids except lactic acid was higher in spring than in summer，liquor quality in spring was better than that in summer，and the content of ethyl caproate in spring was significantly higher than that in summer.

Key words：Nongxiang Baijiu；fermented grains；organic acids；Baijiu