针刺完骨穴对血管性痴呆大鼠海马炎性细胞因子的影响

房雅楠，隋汝波，张　磊

(锦州医科大学：1. 附属第一医院神经内科，辽宁锦州　121001；2. 护理学院，辽宁锦州　121000)



◇中医药研究◇

针刺完骨穴对血管性痴呆大鼠海马炎性细胞因子的影响

房雅楠1，隋汝波1，张磊2

(锦州医科大学：1. 附属第一医院神经内科，辽宁锦州121001；2. 护理学院，辽宁锦州121000)

摘要：目的探讨针刺完骨穴(GB 12)对血管性痴呆大鼠海马炎性细胞因子的影响，为针刺治疗血管性痴呆提供理论依据。方法选用健康SD大鼠(n=54，300～450 g)，随机分为假手术组、血管性痴呆组、针刺组，进行行为学评分并测定海马炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表达，HE染色观察海马组织变化。结果与血管性痴呆组相比，针刺组大鼠学习能力显著提升且炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表达下降；同时，海马神经细胞损伤程度下降，其形态学恢复到接近正常。结论电针完骨穴可以降低海马炎性细胞因子水平，降低神经细胞损伤程度，为血管性痴呆提供了新的神经保护机制。

关键词：血管性痴呆(VD)；海马；细胞因子；针刺；完骨穴；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-1β(IL-1β)

血管性痴呆(vascular dementia, VD)是卒中后常见并发症，发生率高达20%～33%[1]。卒中1年后VD损伤的发生率达70%。伴有VD的卒中患者生活质量严重下降并且有着极高的致死率。目前，虽然对于VD治疗的研究方法很多，但是其发生机制仍尚未阐明[2]。神经生物化学研究、细胞和分子机制研究都报道了VD患者学习记忆受损与海马区神经元变性、坏死、凋亡关系密切[3-5]，研究人员提出了神经解剖学的假说。此外，异常的细胞因子对神经细胞的损害在卒中后认知障碍中占有重要作用[6-8]。BATTI等[9]研究发现，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可能影响大鼠海马在突触传递过程中氧的恢复。 ZULIANI等[10]进一步研究发现，VD患者细胞因子水平的显著增加，证明了细胞因子和VD的严重程度之间有着很强相关性。还有许多方法已被用于治疗，但很少有药物有效。本实验建立VD大鼠模型，探讨针刺完骨穴(GB 12)对VD大鼠海马细胞因子的影响，为针刺治疗VD提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物选用成年雄性SD大鼠54只，体质量300～450 g。给予大鼠自由饮水和进食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活动时间。

1.2大脑中动脉结扎模型(MCAO)的制作及成功评分大鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰卧位固定于手术台上。颈部正中切开后，钝性分离周围组织，暴露左颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)和迷走神经。用微动脉夹暂时夹闭CCA。距CCA分叉处近心端0.5 cm处将CCA剪一小口，插入肝素化的烧头尼龙线从CCA沿着ICA推进，使进入ICA的尼龙线从CCA分叉处到MCA大约18 mm左右，有效地阻断了MCA血流，结扎CCA并固定尼龙线。模型评价为：0分即无神经损伤症状；1分即不能完全伸展对侧前爪；2分即向对侧转圈；3分即向对侧倾倒；4分即不能自发行走，意识丧失；5分即死亡。

1.3分组及针刺穴位刺激干预54只雄性大鼠按随机区组法分为假手术组、血管性痴呆组(VD组)、针刺组，每组18只。VD组仅行MCAO手术；假手术组则将进入ICA的尼龙线从CCA分叉处到大脑中动脉(MCA)大约10 mm左右时，结扎CCA并固定尼龙线(不能抵达MCA，即不能有效阻断MCA血流)；电针组行MCAO手术并应用电子针灸针(苏州华佗医疗电针仪SDZ-Ⅱ)进行电针刺激。完骨穴的定位根据文献[11]描述(解剖位置：耳后的后下和乳突区，深度：0.3～0.5 cm)。参数如下：方波30 Hz，密波100 Hz，强度6～15 V。肢体轻微震动表明针刺成功. 每次刺激20 min，1次/d，持续4月。

1.4Morris水迷宫进行定位航行试验[12]白色圆形水池直径为120 cm，高60 cm，平台高40 cm，平台直径10 cm。水池等分4个象限，任一象限放置平台。水深42 cm，加入奶粉使水显乳白色。各组大鼠每天上午、下午各训练1次，连续2周。90 s仍未找到平台者，则将其放置于平台上站立10 s，第2周至第4周每间隔1 d后，上午将大鼠从平台正对的象限入水，测定每只大鼠学习能力，观察指标为：观察90 s内找到平台的时间(上台潜伏期)。

1.5Real-time PCR检测脑组织炎性细胞因子mRNA表达在进行2月、4月的电针刺激后，处死并分离大鼠脑组织(根据大鼠脑图谱)，留取部分海马组织(备作HE染色)后，Trizol提取大鼠海马组织RNA，反转录成cDNA进行Real-time PCR检测。PCR扩增反应条件：IL-1β和TNF-α循环参数为95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，95 ℃变性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸20 s的循环共40次；IL-6循环参数为95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，进行95 ℃变性10 s→64 ℃退火30 s→72 ℃延伸25 s的循环共40次。

1.6HE染色观察海马CA1区形态学变化在立体定向仪上留取海马CA1区并制作脑组织石蜡切片，进行HE染色，光学显微镜下(×400)观察。

2结果

2.1大鼠定位航行实验结果VD组平均逃避潜伏期为(37.01±7.69)s，与假手术组的(12.89±4.73)s相比，明显延长(P<0.05)，说明VD组SD大鼠出现了学习记忆功能受损。而针刺组大鼠平均逃避潜伏期为(28.19±7.18)s，较VD组明显缩短(P<0.05)，但与假手术组相比仍有延长(P<0.05)。

2.2电针对神经细胞形态学变化的影响实验进行4月后的海马HE染色显示，正常的神经细胞相对较圆而且边界清晰；受损的神经细胞肿胀而且不对称，或核聚集、深染。所有受损的神经细胞都呈三角形；VD组神经细胞受损最明显，细胞肿胀而且不对称，呈三角形；电针组细胞水肿较轻，神经细胞形态接近正常，数量增加(图1)。

2.3TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达情况将提取出的大鼠海马组织RNA，反转录成cDNA进行Real-time PCR检测，通过PCR对TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达进行测定。结果显示，VD组的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达比假手术组高，且差异有统计学意义(第2月P<0.01，第4月P<0.01)，针刺组各炎性因子的mRNA表达比VD组低(第2月P<0.05，第4月P<0.01，图2)。

图1各组海马CA1区域中神经细胞的变化

Fig.1 Changes in nerve cells in the hippocampal CA1 region in each group (HE, ×400)

A：假手术组，箭头所示为正常的神经细胞；B：VD组，箭头所示为受损的神经细胞；C：针刺组，箭头所示为损坏的神经细胞。

图2各组大鼠第2月和第4月海马组织中TNF-α、IL-6 、IL-1β mRNA的表达情况

Fig.2 The mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β in the hippocampal tissues at months 2 and 4, respectively

与假手术组第2月相比，△P<0.01；与假手术组第4月相比，#P<0.01；与VD组第2月相比，*P<0.05；与VD组第4月相比，□P<0.01。

3讨论

随着社会的老龄化，VD已成为日益严重的社会问题。迄今为止已有很多关于VD的理论，但其发病机制仍不清，重要的研究有神经解剖学假说和异常的细胞因子对神经细胞的损害作用[6-8]。最近的研究表明，VD组不仅炎性细胞因子增加而且受损的神经细胞也增加。另有研究表明，适当电治疗可以通过神经调节增加缺血脑组织的血流量而保护脑组织[13]。因此，本研究检测了VD大鼠及针刺完骨穴治疗时，其学习记忆能力的变化及炎性细胞因子在海马组织的表达。结果表明，针刺完骨穴显著降低了VD大鼠逃避潜伏期，提示针刺完骨穴可以改善VD大鼠学习能力，为临床治疗VD提供一定的实验依据。

本研究进一步检测海马炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表达变化并观察VD大鼠海马神经细胞的病理学变化。结果表明，针刺组大鼠学习能力较VD组显著提升，且炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表达下降。同时，海马神经细胞损伤程度下降，其形态学恢复到接近正常。国外NI等[14]研究发现，小脑顶核损害加速胸腺细胞分化为成熟的T辅助淋巴细胞，并能提高外围免疫组织的T辅助淋巴细胞的功能，提示免疫系统由小脑顶核大幅调节。有研究也有类似结果，电刺激小脑顶核不仅抑制星形胶质细胞的过度增殖，而且可减轻伴有缺血缺氧脑损伤新生大鼠的星形细胞结构损害[15]。因此，本研究针刺完骨穴时，观察到可稳定细胞因子，降低海马损伤，增进学习记忆能力，其可能与针刺小脑顶核(完骨穴位)使免疫系统抑制，防止炎性细胞因子过度产生有关。这可能为探索VD的发病机制和选择治疗目标提供了新的途径。但是，观察炎性细胞因子变化的时间相对较短，也没有观察细胞因子对于海马长期的影响。这尚需进一步实验研究。

参考文献：

[1] 汪洋. 血管性痴呆的常见临床类型及其危险因素分析[D]. 大连医科大学, 2013.

[2] ROCHER MN, CARRE D, SPINNEWYN B, et al. Long-term treatment with standardized Ginkgo biloba extract (EGb 761) attenuates cognitive deficits and hippocampal neuron loss in a gerbil model of vascular dementia[J]. Fitoterapia, 2011, 82(7):1075-1080.

[3] WANG F, GENG X, TAO HY, et al. The restoration after repetitive transcranial magnetic stimulation treatment on cognitive ability of vascular dementia rats and its impacts on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area[J]. J Mol Neurosci, 2010, 41(1):145-155.

[4] 槐雅萍. 左旋丁苯酞对血管性痴呆小鼠认知功能的影响及对PI3K/Akt信号转导通路的作用[D]. 河北医科大学, 2013.

[5] 杨申. P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表达及其学习记忆能力的影响[D]. 山东大学, 2013.

[6] ROSENBERG GA. Inflammation and white matter damage in vascular cognitive impairment[J]. Stroke, 2009, 40:20-23.

[7] TROLLOR JN, SMITH E, BAUNE BT, et al. Systemic inflammation is associated with MCI and its subtypes, the Sydney Memory and Aging Study[J]. Dement Geriatr Cogn Disord, 2010, 130:569-578.

[8] ANGELOPOULOS P,AGOURIDAKI H,VAIOPOULOS H, et al. Cytokines in Alzheimer's disease and vascular dementia[J]. Int J Neurosci, 2008, 118:1659-1672.

[9] BATTI L, O'CONNOR JJ. Tumor necrosis factor-alpha impairs the recovery of synaptic transmission from hypoxia in rat hippocampal slices[J]. J Neuroimmunol, 2010, 218:21-27.

[10] ZULIANI G, RANGING M, GUERRA G, et al. Plasma cytokines profile in older subjects with late onset Alzheimer’s disease or vascular dementia[J]. J Psychiatr Res, 2007, 41:686-693.

[11] 解越，刘泓，周炜，等. 多种针法联合治疗卒中恢复期吞咽困难疗效观察[J]. 中国中医西结合杂志, 2011, 31(6):736-740.

[12] 方松，余化霖. Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展[J]. 国际病理科学与临床杂志, 2010, 30(4):321-326.

[13] ZHOU F, GUO JC, CHENG JS, et al. Electure increased cerebral blood flow and reduced ischemic brain injury, Dependence on stimulation intensity and frequency[J]. J Appl Physiol, 2011, 111:1177-1187.

[14] NI SJ, QIU YH, LU JH, et al. Effect of cerebellar fastigial nuclear lesions on differentiation and function of thymocytes[J]. J Neuroimmunol, 2010, 222:40-47.

[15] 顾海燕，赵德育，王全. 维生素D缺乏对子代大鼠肺形态结构及血小板源性生长因子-A表达的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2011, 13(4):326-330.

(编辑国荣)

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-09

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81241050；No.81371461)

通讯作者：张磊. E-mail: 264437699@qq.com；隋汝波. E-mail: suirubo521@aliyun.com

中图分类号：R741

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604024

Electroacupuncture at the Wangu acupoint suppresses expression of inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia

FANG Ya-nan1, SUI Ru-bo1, ZHANG Lei2

(1. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001; 2. Department of Nursing, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo examine whether electroacupuncture at the Wangu acupoint (GB 12), whose position is similar to the cerebellar fastigial nucleus, can reduce inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia (VD) to provide theoretical evidence for treating VD with electroacupuncture. MethodsHealthy Sprague-Dawley rats (n=54, 300-450 g) were randomly divided into three groups: sham surgery group, VD group, and electroacupuncture group. The ethologic scores of VD rats were evaluated and the mRNA expressions of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) in the hippocampus were assessed and the hippocampal tissues were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. ResultsCompared with VD group, in electroacupuncture group the rats’ learning ability improved significantly and the mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β decreased. Simultaneously, the damage extent of nerve cells in the hippocampal tissues decreased, and their morphology recovered to nearly normal. ConclusionElectroacupuncture at the Wangu acupoint can decrease the level of inflammatory cytokines in the hippocampus and reduce the damage extent of nerve cells in the hippocampus, thus providing a new neuroprotective method for VD.

KEY WORDS:vascular dementia (VD); hippocampus; cytokine; electroacupuncture; Wangu acupoint; TNF-α; IL-6; IL-1β

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81241050 and 81371461)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160412.1722.002.html(2016-04-12)