HPLC测定红凤菜总黄酮含量

任冰如，陈　剑，吕　寒，梁呈元，吴菊兰，刘　艳，李维林

(江苏省中国科学院植物研究所， 江苏 南京 210014)



HPLC测定红凤菜总黄酮含量

任冰如，陈剑，吕寒，梁呈元，吴菊兰，刘艳，李维林*

(江苏省中国科学院植物研究所， 江苏 南京 210014)

摘要用70%甲醇浸提红凤菜样品的干燥粉末，将所得浸膏进行酸解，以槲皮素、山柰酚为对照品，用HPLC对酸解液进行测定，经计算得到红凤菜样品的总黄酮含量，为红凤菜的资源利用提供依据。结果表明，红凤菜样品的总黄酮含量为：嫩芽0.0326 mg·g-1DW，嫩叶 0.1171 mg·g-1DW，成熟叶片 0.1081 mg·g-1DW，整株样品 0.1227 mg·g-1DW；所有样品酸解液中的山柰酚含量均高于槲皮素。红凤菜嫩芽的总黄酮含量最低，整株样品的总黄酮含量不低于其他样品；山柰酚是红凤菜总黄酮的主要苷元。

关键词红凤菜；高效液相法；总黄酮；槲皮素；山柰酚

红凤菜(GynurabicolorDC.)为菊科菊三七属植物[1]，别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，原产于我国南方各地。红凤菜具有活血止血、解毒消肿的功用[2]，作为民间药全草入药；红凤菜含有丰富的营养成分[3]，作为保健蔬菜在我国多个地区有栽培和销售。

前人对红凤菜活性成分的研究表明，红凤菜含有黄酮类物质[4-7]，而黄酮类成分多具有保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[8]。

研究人员采用硅胶、聚酰胺、凝胶柱层析等分离手段，从红凤菜中分离得到单体化合物，通过波谱数据、理化性质等分析方法鉴定了化合物的结构[4-5]，又用LC-MS技术研究了红凤菜提取物的化学成分[6-7]，确定红凤菜中的黄酮类成分主要有槲皮素、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-α-L-鼠李糖苷和高车前苷，可见红凤菜的黄酮类物质主要由槲皮素、山柰酚及以槲皮素或山柰酚为苷元的黄酮苷组成。

任冰如等[9]采用“乙醇提取-大孔树脂柱层析-聚酰胺柱层析-重结晶”的方法，从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮，在提取分离的不同阶段采集样品，经LC-MS定性检测，确定样品中的黄酮类成分是以槲皮素或山柰酚为苷元的黄酮苷，将这些样品水解后用HPLC测定，均只得到槲皮素和山柰酚的吸收峰，进一步证实了红凤菜的黄酮类物质主要由槲皮素、山柰酚及以槲皮素或山柰酚为苷元的黄酮苷组成[10]。

关于红凤菜总黄酮含量的测定方法，目前文献报道的均采用比色法[11-12]，但该法专属性较差[13]。 由于植物中的黄酮类物质是由多种苷元及其糖苷所组成的混合物，成分复杂多样，难以直接检测每种成分的含量，通常将总黄酮水解后测定水解液中苷元的含量，再用系数换算成总黄酮含量[14-18]。

本文参考钱大玮等[15]的方法，将红凤菜的甲醇提取物进行酸水解，以槲皮素和山柰酚为对照，采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography HPLC)检测水解液中槲皮素和山柰酚的含量，再根据前期LC-MS实验所确定的红凤菜黄酮苷的种类及其分子量[7,9-10]，确定换算系数，计算总黄酮含量。

1材料与方法

1.1材料与试剂

红凤菜于2003年7月引自中国重庆, 凭证标本号0648614，凭证标本保存于江苏省中国科学院植物研究所标本馆 (NAS)，红凤菜样品采自江苏省中国科学院植物研究所实验苗圃，于2013年6月下旬采摘20株，由上往下分为芽～倒1叶(样品1)、倒2～3叶(样品2)和倒4～5叶(样品3)，分别作为嫩芽、嫩叶和成熟叶片的样品，同时采摘10株完整的地上部分(样品4)作为整株样品。所有样品用流水冲洗，在通风处摊晾至萎蔫后，在105 ℃杀青10 min，60 ℃烘干，用电动粉碎机研磨，过二号筛(24目)，60 ℃恒重后置干燥器中保存备用。

分析纯甲醇由南京化学试剂有限公司生产，高效液相所用色谱纯甲醇购自Tedia公司，槲皮素对照品购自中国药品检定研究院，批号100081-200907，纯度96.5%；山柰酚对照品购自中国食品药品检定研究院，批号110861-200808，纯度95.9%。

1.2仪器与设备

DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪；METTLER TOLEDO EL 204 电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产；KQ-300DE型数控超声波清洗器，由昆山市超声仪器有限公司生产。

1.3方法

1.3.1供试品溶液制备

称取红凤菜样品5 g左右(精确到0.000 1 g)置100 mL三角瓶中，加入25 mL 70 %甲醇，浸泡过夜，超声波提取30 min(80%功率)，过滤，用相同方法共提取3次，合并滤液在80 ℃水浴上蒸去溶剂得到浸膏，分次加入V(甲醇)∶V(25% HCl)=4∶1的溶液共30 mL，将浸膏溶解后在93 ℃水浴上回流1 h，冷却后用分析纯甲醇定容到50 mL，得到酸解液用于HPLC法测定总黄酮。

1.3.2对照品溶液制备

精密称取槲皮素对照品7.16 mg，山柰酚对照品7.15 mg，分别用色谱纯甲醇定容至25 mL，得到对照品贮备液，取槲皮素对照品溶液0.25 mL、山柰酚对照品溶液0.25 mL，用色谱纯甲醇定容到50 mL，得混合对照品溶液，考虑对照品的纯度，计算得对照品工作液中槲皮素的质量浓度为1.3 82 μg·mL-1，山柰酚的质量浓度为1.3 71μg·mL-1。

色谱柱为Welch Material XB-C18柱(4.5 mm×250 mm，粒径5 μm)，以甲醇∶0.4 % 磷酸水溶液(55∶45)为流动相，检测波长为360 nm，流速1mL·min-1，柱温30 ℃。

1.3.3标准曲线制作

取混合对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30 μL，进行HPLC测定，根据出峰时间记录槲皮素和山柰酚的峰面积，以进样量(x, μg)对峰面积积分值(y)进行线性回归，得槲皮素的回归方程为：y=0.029 5x+0.000 3(r=0.999 4)，在0.006 91～0.041 46 μg 范围内呈线性相关；山柰酚的回归方程分别为：y=0.020 8x+0.001 5(r=0.999 7)，在0.006 86～0.041 33 μg范围内呈线性相关。

1.3.4样品测定

按照“1.3.3 标准曲线制作”的色谱条件进行样品测定，样品进样量为30 μL。

2结果与分析

用以上方法测得红凤菜对照品和样品1的HPLC图谱如图1所示，槲皮素和山柰酚的分离效果较好，样品1中山柰酚的吸收峰明显高于槲皮素。根据检测数据计算样品中的槲皮素和山柰酚含量，结果如表1所示，4份红凤菜样品的槲皮素含量均很低，植株嫩芽即样品1(芽～倒1叶)的含量仅为0.001 6 mg·g-1，嫩叶即样品2(倒2～倒3叶)的含量仅为0.002 8 mg·g-1，而成熟叶片即样品3(倒4～倒5叶)和完整的地上部分即样品4甚至未被检出，说明红凤菜的黄酮苷元主要是山柰酚。

A. 混合对照品:1. 槲皮素，2. 山柰酚；B. 红凤菜样品1: 4. 槲皮素，5. 山柰酚

为了更准确地表示红凤菜样品的总黄酮含量，将测得的苷元即槲皮素和山柰酚的含量转换为其水解之前的黄酮苷含量。陈剑[7]及任冰如 等[9]的LC-MS实验结果表明，红凤菜提取物中的黄酮类成分主要由以槲皮素为苷元的槲皮素糖苷和以山柰酚为苷元的山柰酚糖苷组成，其中槲皮素糖苷又有2种不同的相对分子质量，即槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-α-L-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷(相对分子质量610)、槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(相对分子质量464)，由于难以确定不同相对分子质量的槲皮素糖苷在样品中所占的比例，因此暂定取两者的平均值来估算槲皮素糖苷的相对分子质量，即(610+464)/2=537，因为槲皮素的相对分子质量为302，所以将槲皮素换算成槲皮素糖苷的系数为537/302=1.78。同样，山柰酚糖苷也有2种不同的相对分子质量，即山柰酚-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖-α-L-鼠李糖苷(相对分子质量594)、山柰酚-3-O-半乳糖苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(相对分子质量448)，取两者的平均值估算山柰酚糖苷的相对分子质量，即(594+448)/2=521，山柰酚的相对分子质量为286，将山柰酚换算成山柰酚糖苷的系数为521/286=1.82。

根据以上推导的转换系数，将测得的黄酮苷元(槲皮素和山柰酚)含量折算为黄酮苷(槲皮素糖苷和山柰酚糖苷)含量，并以(槲皮素糖苷+山柰酚糖苷)的含量表示红凤菜样品的总黄酮含量，结果如表1所示。由表1可见，红凤菜嫩芽的总黄酮含量明显低于其他部位，仅为0.032 6 mg·g-1；嫩叶及成熟叶的总黄酮含量差别不大，分别为0.117 1 mg·g-1和0.108 1 mg·g-1；完整地上部分的总黄酮含量为0.122 7 mg·g-1，不低于其他样品。

3讨论

本文首次以槲皮素和山柰酚为对照品，采用高效液相色谱法较准确地测定了红凤菜的总黄酮含量，结果显示，红凤菜样品的总黄酮含量为0.032 6～0.122 7 mg·g-1DW，与其他几种蔬菜[19-20]相比，红凤菜的总黄酮含量较低。

鉴于红凤菜整株样品的总黄酮含量不低于其嫩芽、嫩叶及成熟叶片，如欲从红凤菜中提取分离总黄酮，无需对不同部位进行分拣，可以直接以整株为原料进行提取。

在本文的测定条件下，红凤菜样品中黄酮苷元槲皮素的吸收峰基线不平、峰面积极小，在样品3和样品4中甚至未被检出，其原因主要是样品中的黄酮苷元成分槲皮素含量过低。虽然如此，本文以高效液相法测定红凤菜中的总黄酮含量，与以往的比

色法[11-12]相比有更好的专属性，数据更为可靠。

本文结果显示，在所有待测样品中，黄酮苷元山柰酚的含量远远高于槲皮素，说明红凤菜的黄酮苷元以山柰酚为主，这与作者之前的分析结果[10]是一致的。

4结论

红凤菜地上部分总黄酮含量较低，仅为0.032 6～0.122 7 mg·g-1DW，其中嫩芽的总黄酮含量最低，而完整地上部分的总黄酮含量不低于嫩芽、嫩叶及成熟叶片；红凤菜的黄酮苷元以山柰酚为主。

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Content of Total Flavonoids inGynurabicolorDetected with HPLC

Ren Bingru, Chen Jian, Lü Han, Liang Chengyuan, Wu Julan, Liu Yan, Li Weilin*

(Institute of Botany, Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China)

AbstractThe total flavonoids ofGynurabicolorwere extracted with 70% methanol, hydrolyzed by acid, and detected with HPLC using quercetin and kaempferol as reference substance. Content of total flavonoids inG.bicolorwas 0.032 6 mg·g-1DW in apical bud, 0.117 1 mg·g-1DW in tender leaves, 0.1081 mg·g-1DW in mature leaves and 0.122 7 mg·g-1DW in the total aerial parts, respectively. Contents of kaempferol were higher than quercetin in all samples. Total flavonoids was lowest in apical bud and higher in the total aerial parts. Kaempferol is the main aglycon of flavonoids inGynurabicolor.

Key wordsGynurabicolor; HPLC; total flavonoids; quercetin; kaempferol

收稿日期：2015-07-12

基金项目：江苏省产学研联合创新资金(BY2012213)；江苏省科技基础设施建设计划—科技公共服务平台项目(BM2011117)。

作者简介：任冰如(1964—)，女，主要从事植物资源的研究与开发。E-mail: bingruren@126.com *通讯作者：李维林。E-mail: lwlcnbg@mail.cnbg.net

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.01.008

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1006-9690(2016)01-0028-03