双黄连注射液对肥大细胞组胺及己糖胺酶释放的影响

叶 宇 柳 杰（大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116000）



双黄连注射液对肥大细胞组胺及己糖胺酶释放的影响

叶 宇 柳 杰*
（大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116000）

【摘要】目的 建立双黄连注射液评价肥大细胞介质释放可行性。方法 不同浓度双黄连注射液与大鼠体内肥大细胞共孵育，测定引起的组胺及己糖胺酶的释放率，分析比较各组差异性。结果 阳性对照药Compound 48/80能引起肥大细胞组胺及己糖胺酶的显著释放，不同浓度双黄连注射液引起组胺及己糖胺酶释放与生理盐水组无差别。结论 大鼠肥大细胞自身释放组胺及己糖胺酶较多，不适于体外评价双黄连注射液引起过敏介质释放。

【关键词】过敏；肥大细胞；组胺；己糖胺酶

双黄连注射剂是由金银花、黄芩、连翘经提取制成的无菌的中药复方制剂，具有清热解毒、疏风解表等功效，对热毒邪气引起的发热、咽痛、等疾病均有良好疗效。临床上常用于治疗感染性疾病，尤其是呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。是国家中医药管理局确定的首批全国中医院急诊科必备中成药之一，收录在2005年版《中国药典》中。但近年来，随着临床应用的日益广泛，药物不良反应（ADR）报道例数明显增多，安全性问题引起人们的关注。

资料显示，双黄连注射剂致不良反应主要为急性过敏反应，其发生时间主要集中于首次给药过程中及给药当天，以用药过程中的前30 min最为高发［1］。由此可见，双黄连注射剂引起的急性过敏反应以类过敏反应为主，其发生机制为药物成分直接作用于肥大细胞和嗜碱性细胞，而非抗原抗体反应。有研究表明，双黄连注射液中的绿原酸及黄芩苷可能为其致敏性成分［2］，本研究通过双黄连注射剂不同浓度对肥大细胞作用，测定其组胺及己糖胺酶释放，从整体注射液整体方面评价其致敏性。

1　试剂与仪器

大鼠组胺ELISA测试盒购于北京中昊时代生物技术中心；PBS缓冲液及HBSS缓冲液购于Hyclone公司；双黄连注射液，哈药三精药业，批号：06091313；Compound 48/80、4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide、Percoll分离液、台盼蓝、甲苯胺蓝购于Sigma-Aldrich公司；Triton X-100购于Amresco公司，柠檬酸钠、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠购于天津科密欧化学试剂公司。

CellMate Ⅱ移液器（Matrix，USA）；Finnpipette可调式移液器（Thermo）；HZS-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发公司）；酶标仪（Infinite M2000，Tecan）；生理盐水（赤峰荣济堂药业有限公司）。

试验动物：大鼠，♀，体质量200 g左右，购于大连医科大学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK（辽） 2008-2002。

2　实 验

2.1 双黄连注射剂引起肥大细胞组胺及己糖胺酶释放：参照文献［3］方法，取健康雄性大鼠，眼球放血致死。剪开腹部皮肤，将皮肤向两侧翻开，腹腔注射15 mL不含钙、镁的HBSS缓冲液。注射后轻轻按摩腹部60 s，打开腹腔，腹腔内容物推向一侧，吸管收集腹腔液于试管中，4 ℃，1500 rpm离心10 min，取细胞悬液，缓缓加入30%∶80%的Percoll梯度分离液中，4 ℃，2500 rpm离心15 min，以PBS液洗涤2次（4 ℃，1500 rpm离心10 min），收集界面细胞，悬浮于PBS中，调整细胞密度至5×105个/毫升，台盼蓝染色检测细胞活力，细胞活力＞95%，甲苯胺蓝染色，纯度＞95%，待用。

细胞悬液100 μL加入EP管中，加入不同浓度药品溶液200 μL， 37 ℃孵育30 min。4 ℃，1500 rpm离心10 min，吸取细胞上清液50 μL，按照上述方法测定细胞上清液中组胺及己糖胺酶含量。

2.2 ELISA方法测细胞组胺释放率：上述细胞与药物孵育30 min后，取上清液50 μL，按照组胺测试盒中标准操作规程测定并计算各浓度样品溶液组胺释放率。采用组胺对数浓度Log （C）与吸光度A做线性曲线，其线性方程为y=-0.5097x+1.2258，R2=0.9755。

2.3 己糖胺酶释放率测定方法：上述细胞与药物孵育30 min后，吸取50 μL上清液加入到含有50 μL以0.1 M柠檬酸缓冲液配制的浓度为1 M底物（4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide）的96孔板中，37 ℃孵育1 h，以0.1 M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液200 μL终止反应，于405 nm处测量吸光度值。各浓度样品溶液引起的吸光度值与完全释放组吸光度值比值为释放率。

3　结果与讨论

图1 双黄连注射剂引起肥大细胞组胺释放

图2 双黄连注射剂引起肥大细胞己糖胺酶释放

按照上述方法测得的双黄连注射液引起肥大细胞组胺及己糖胺酶释放，结果见图1、2。目前，尚未有合适的以肥大细胞作为评价模型的药物体外过敏反应评价方法。本实验结果显示，虽然Compound 48/80具有直接刺激肥大细胞释放组胺及己糖胺酶的作用，其组胺及己糖胺酶释放率可达80%，均显著高于生理盐水组。但是，双黄连注射液不同浓度给药组与生理盐水组引起组胺及己糖胺酶释放率未见差异，原因在于肥大细胞自发释放的组胺及己糖胺酶较高，双黄连注射液对其作用引起的这两种介质的释放较少或者不同浓度药物引起两种介质的释放无差异。因此，虽然肥大细胞是过敏反应中过敏介质释放的主要来源，但由于其自身释放等原因，采用肥大细胞作为评价注射液释放组胺及己糖胺酶的模型并不合适。

参考文献

［1］ 程光文，曾婧，毛宗福.影响双黄连注射剂不良反应的因素分析［J］.中国现代药物应用，2010，4（4）:4-5.

［2］ 袁丽燕，黄洪林，涂海华.双黄连注射剂的不良反应研究［J］.中国中医药信息杂志，2010，10（17）:41-42.

［3］ 王钦富，王永奇，于超，等.炒紫苏子醇提取物对肥大细胞脱颗粒及组胺释放的影响［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（1）:30-32.

中图分类号：R282.710.7

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）08-0028-01

*通讯作者：E-mail： heriness@126.com