胶原酶对兔假体包膜羟脯氨酸含量的影响

申志惠，王　黔，吕晓岩中国医学科学院整形外科医院研究中心

胶原酶对兔假体包膜羟脯氨酸含量的影响

申志惠，王黔，吕晓岩
中国医学科学院整形外科医院研究中心

目的：应用外源性胶原酶制剂作用于假体包膜，通过测定包膜组织的羟脯氨酸含量来反应出其胶原代谢状况，从而探索防止扩张器假体包膜过度纤维化而形成挛缩的一个新途径。方法：分三组在实验家兔背部皮下组织埋入同等规格大小的扩张器硅胶壶，实验组及生理盐水组每隔一周壶上分别注射同等剂量的胶原酶制剂及生理盐水，空白组不做任何注射作为对照，14天和35天后分别取出三组硅胶壶等同部位的包膜组织进行羟氨酸含量测定。结果：空白组和生理盐水组羟脯氨酸含量随时间逐惭升高，而胶原酶组呈下降趋势。空白组和生理盐水组羟脯氨酸含量无明显差异（P>0.05）；空白组和生理盐水组羟脯氨酸含量明显高于胶原酶组（P<0.05）。结论：胶原酶制剂能有效降低家兔假体包膜组织中羟脯氨酸含量，抑制胶原纤维的合成。

胶原酶；实验家兔；羟脯氨酸；胶原纤维

羟脯氨酸这种氨基酸存在于机体组织胶原纤维和蛋白质中，是胶原特有的一种氨基酸，其含量可以代表反应出组织中胶原的含量，和机体的胶原分子紧密相关。胶原酶是胶原蛋白溶解酶，对胶原分解代谢起着特殊的功能。纤维包膜的形成过程类似于创伤修复中瘢痕组织的形成过程，均与胶原的合成与分解代谢有关系，本实验通过胶原酶药物干预实验家兔制模的硅胶壶上的包膜组织，测定其组织中羟脯氨酸的含量，以探讨利用胶原酶降解包膜组织中胶原蛋白含量来防治假体包膜挛缩的可能性。

1.材料

1.1实验动物

健康普通级实验家兔（北京隆安动物养殖中心）20只。雌雄不限，体重2.5~3.5㎏，4~5月龄。

1.2手术麻醉药配制

速眠新和氯胺酮按1:1等体积混合配剂，按0.3ml/kg体重肌注麻醉实验家兔。

1.3胶原酶

注射用胶原酶（collagenase）上海乔源生物制药有限公司，批号：国药准字H31022659。

1.4羟脯氨酸（hydroxyproline）上海远慕生物科技有限公司

羟脯氨酸应用液 10ug/ml:称1mg羟脯氨酸溶于100ml0.001NHcl中。

1.5分光光度计（Beckmen,USA）。

2.方法

2.1动物模型标本的制作

实验家兔20只，每只家兔麻醉，通过手术将三个直径1.7cm,高0.7cm规格等同的圆形扩张器硅胶壶分前中后埋于实验家兔背部。前部为实验用药组，每周往壶上注射配制好的含不同单位活性的胶原酶制剂1ml。中部为生理盐水组，每周往壶上注射1ml生理盐水。后部为空白组，不做任何注射作对照。三组分别于术后第14天和35天手术剥取包裹在硅胶壶上相同部位的包膜组织，平铺于无菌沙布上凉干，待作羟脯氨含量测定。

2.2包膜组织样本的处理及测定

2.2.1水解

称取各个部位重量一致的干组织15mg切碎，用6N Hcl进行水解。水解在16×150 mm带帽螺旋管中进行，标本和盐酸的最终体积为2 ml，放烤箱中加热。条件是3小时，130℃，这是羟脯氨酸回收的最宜时间和温度。

2.2.2水解产物的中和

(1)取水解试管加2滴0.02%甲基红指示剂。

(2)然后加2.4 ml 2.5N NaoH于每管中进行中和。

(3)用1N,0.1N NaoH和1N,0.1N Hcl精细调至淡黄色出现，手振动试管混匀，PH调为7左右。

(4)然后将调好的水解液用蒸馏水稀释至15ml过滤待用。

2.2.3氧化抽提（显色反应）

(1)吸取2ml水解滤液。

(2)加1ml0.05M氯胺T溶液于各管中充分混合，在室温下放置20分钟。

(3)依次在每管中加1ml对二甲氨基苯甲醛溶液混合，然后放60℃水浴20分钟，取出后冷却。

2.2.4测定

空白调零，于561nm分光光度计比色。参照石冰[1]的方法，我们在实验中设立空白管和标准管，标准管中加入10ug/ml羟脯氨酸应用液。计算公式为：Hpr含量（mg/g）=T/S×10ugml-1×10/1000(T：被测管光密度，S：标准管光密度)

2.2.5统计学处理

应用SPSS.17.0统计学软件对实验结果进行统计学处理，计量资料以±S表示，组间比较采用方差分析检测，α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

将测得的吸光度值代入公式计算出各标本的羟脯氨酸含量。各组羟脯氨酸含量随时间呈逐渐升高，而胶原酶组羟脯氨酸含量在各时间点均低于空白组及生理盐水组（植入后14天，p<0.05；植入后35天，p<0.01）。空白组和生理盐水组羟脯氨酸含量无明显差异（p>0.05）。

4.讨论

整形外科假体法乳房再造术和假体隆胸术中，硅凝胶假体的植入对于人体来说是一种异物，植入人体后引起局部组织的反应，形成纤维组织包裹。本研究利用胶原酶对胶原蛋白降解作用这一特性，用胶原酶制剂减少假体包膜组织中的胶原蛋白的含量，从而达到减轻硅胶假体纤维囊挛缩的作用。样本羟脯氨酸含量检测结果显示，术后14天，生理盐水组羟脯氨酸含量比空白组的略有增加，可能是注射盐水操作刺激所引起的成纤维细胞增生或胶原蛋白沉积略有增加所致，但两组间无显著性差异。胶原酶组羟脯氨酸含量低于生理盐水和正常对照组（P<0.05），说明药物在早期已经开始发挥作用。术后21天到30天是创伤愈合瘢痕增生期，一般认为这是由成纤维细胞异常增生，胶原大量合成，过度沉积所致，此期用药有望明显降解胶原蛋白。术后35天，胶原酶组羟脯氨酸含量明显低于空白组及生理盐水组，进一步显示胶原酶对假体包膜组织中的胶原蛋白的降解作用。通过以上实验结果表明：胶原酶制剂可以使假体包膜组织中胶原蛋白含量明显减少，从而缓解包裹假体周围纤维包膜的紧张度，对预防假体包膜挛缩可能具有一定的防治作用。

[1]石冰,柳大烈,马小峰.胎免皮肤在正常发育及创伤愈合过程中羟脯氨酸的含量比较[J]沈阳部队医药,1999,12(4)295-298

[2]宋儒耀,方彰林.美容整形外科学（增订版）.北京:北京出版社，1990.

[3]Brody Gs.On the safety of breast implants.Plastic and recon⁃structive surgery[J].1997,100:1314-21.