CDKN2A、CDKN2B、MEF2A、VEGF基因表达与冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的相关性

丁夏峰，胡申江

（浙江大学医学院附属第一医院心内科，杭州310003）



CDKN2A、CDKN2B、MEF2A、VEGF基因表达与冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的相关性

丁夏峰，胡申江

（浙江大学医学院附属第一医院心内科，杭州310003）

摘要目的比较细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A（CDKN2A）、CDKN2B、肌肉细胞特异性增强因子2A（MEF2A）以及血管内皮生长因子（VEGF）基因表达在冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）患者和健康人之间的表达差异，以期探寻CHD可能的发病机制。方法选取CHD患者154例（CHD组）和健康者123例（正常对照组），留取全部研究对象的血液标本。通过实时定量PCR法检测CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表达；通过ELISA定量检测血清中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF的含量。结果实时定量PCR结果发现，CHD组CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA表达量分别为0.011 5± 0.002 1、0.003 3±0.000 4、0.302 6±0.035 6和0.022 1±0.004 2，均显著低于正常对照组（分别为0.048 4±0.015 6、0.007 1±0.001 2、0.823 0±0.075 1和0.052 7±0.001 3），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。ELISA检测结果表明，CHD组血清CDKN2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF的表达量分别为（121.60±7.96）、（65.07±5.42）、（6.51±0.83）和（19.41±1.62）μg/mL，均显著低于正常对照组［分别为（236.90±29.13）、（155.70±22.52）、（15.96±2.86）和（39.87±4.54）μg/mL］，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论CHD患者血液中有核细胞内CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表达水平以及血清中蛋白的表达水平都显著低于健康人群，提示这4个基因可能直接影响或间接参与CHD的发生、发展。

关键词冠状动脉粥样硬化性心脏病；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B；肌肉细胞特异性增强因子2A；血管内皮生长因子

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心血管疾病是全球导致患者死亡的重大疾病之一，在众多致死病因中居第2位，发病率约为319/ 10万［1］。冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）简称冠心病，是最常见的心脏疾病。其发病机制十分复杂，既有环境因素，也有遗传特征［2-3］，每年将近250万的患者死于CHD相关疾病［4］。研究显示，脂类代谢异常、吸烟、糖尿病和高血压是CHD的主要致病因素，约占CHD发病的60%，且此结论已通过最新技术——全基因组关联研究得到进一步确认［5］，同样的证据在中国人体内也得到验证［6］。其中主要涉及到多个基因的单核苷酸多态性位点变化，涉及基因包括磷酸酶和肌动蛋白调控因子1（phosphatase and actin regu1ator 1，PHACTR1）、转录因子21（transcription factor 21，TCF21）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A（cyc1in - depedent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、CDKN2B、C12orf51等［7］。除此之外，也有报道称血管内皮生长因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）和肌肉细胞特异性增强因子2A（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）也与CHD发病具有相关性［8］。VEGF能够促进血管增殖和增加血管壁透性，血液中VEGF浓度增高能够刺激血管平滑肌细胞发生变化，这与CHD的发病有相关性［9］；MEF2A是MADS盒的转录因子，参与心肌发育、血管形成，在冠状动脉内皮细胞高表达，此基因的多态性与有CHD家族史的患者明显相关。本研究通过检测血细胞CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA及其血浆蛋白的表达水平，探讨其与CHD发生、发展的内在可能关联。

1　材料与方法

1.1入选标准

收集2010年5月至2013年2月在上虞市人民医院心内科就诊并进行冠状动脉造影术的患者。入选标准：冠状动脉造影术显示冠状动脉狭窄＞50%，或者经临床症状、心肌酶谱以及心电图明确诊断为CHD的患者。以此标准筛选出患者共154例（男84例，女70例），作为CHD组。选取疑似CHD但经本院心内科诊断为CHD阴性，并且无心脏相关疾病、肿瘤、感染和糖尿病以外的内分泌疾病等影响因素的健康者123例（男61例，女62例），作为正常对照组。记录、统计纳入研究中的所有研究对象的性别、年龄、吸烟、伴发糖尿病、高血压、高血脂症以及服药史。

1.2实验方法

1.2.1血细胞中RNA的抽提：取全血50 μL加入1 mL红细胞裂解液（0.15 mo1/L的NH4C1、10 mmo1/L的NaHCO3、1 nmo1/L的EDTA）混匀并室温静置30 min，10 000 r/min离心1 min后加入1 mL Trizo1，静置5 min，加入200 μL的氯仿，涡旋震荡均匀，静置5 min后12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清并加入等体积异丙醇，室温静置沉淀RNA约30 min，12 000 r/min、4℃离心15 min，用DEPC水配置的75%乙醇洗涤1遍后风干，加入30 μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2实时定量-PCR测定血细胞中相关基因mRNA含量：应用日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Rea1 Time）快速逆转录试剂盒，按照说明书操作流程，将抽提的RNA逆转录成cDNA，并应用TaKaRa公司SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（T1i RNaseH P1us）荧光定量PCR试剂盒，定量检测CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA在血细胞中的相对表达量。引物［14］：MEF2A F 3′-GGTCTGCCACCTCAGAACTTT-5′，R 3′-CCCTGGGTTAGTGTAGGACAA-5′；Cdkn2aF 3′-GGGTTTTCGTGGTTCACATCC-5′，R 3′-CTAGACG CTGGCTCCTCAGTA-5′；Cdkn2bF 3′-CCCACAACG ACTTTATTTTC-5′，R 3′-GCAGCCTTCATCGAATTA-5′；VEGF F 3′-CGCAGCTACTGCCATCCAAT-5′，R 3′-GTGAGGTTTGATCCGCATAATCT-5′；GAPDHF 3′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-5′，R 3′-TCTAGA CGGCAGGTCAGGTC-5′。

1.2.3ELISA测定血清中相关蛋白含量：分别取2组患者10 μL血清，加入样品稀释液40 μL，每孔加入辣根过氧化物酶标记的CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF的检测抗体（100 μL），封板膜封住并37℃培养箱静置60 min；弃掉上清液，吸水纸拍打吸干，每孔加入约300 μL洗涤液，静置1 min，弃去，重复5次，洗净抗体残留，每孔顺序加入底物溶液各50 μL，并在37℃培养箱避光孵育15 min；最后，加入终止液（50 μL /孔），在450 nm波长处检测吸光值。

1.3统计学分析

利用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，计数资料以频数和百分比表示，组间比较采用t检验和χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般资料比较

CHD组患者的年龄显著高于正常对照组（P＜0.01），说明年龄与CHD的关系密切。CHD组92例（59.7%）患者伴发高血压，113例（73.4%）患者伴发高血脂，CHD组伴发高血压患者的比例和伴发高血脂患者的比例均显著高于正常对照组（P＜0.01）。此外，2组的性别比例、吸烟情况、伴发糖尿病和伴发高胆固醇的比例均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1　CHD组和正常对照组一般资料比较Tab.1 Comparison of general characterizations between CHD group and control group

2.2血细胞CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA表达的比较

CHD组患者CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA表达水平分别为0.011 5±0.002 1、0.003 3±0.000 4、0.302 6±0.035 6和0.022 1±0.004 2，均低于正常对照组（分别为0.048 4±0.015 6、0.007 1± 0.001 2、0.823 0±0.075 1和0.052 7±0.001 3），差异均有统计学意义（均P＜0.000 1）。见图1。

2.3血浆中MEF2A、CDKN2A、CDKN2B和VEGF蛋白表达的比较

ELISA结果显示，CHD组患者血浆中CDK2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF蛋白浓度分别为（121.60±7.96）、（65.07±5.42）、（6.51±0.83）、（19.41± 1.62）μg/mL，正常对照组分别为（236.90±29.13）、（155.70±22.52）、（15.96±2.86）、（39.87±4.54）μg/mL，CHD组均显著低于正常对照组，差异均有统计学意义（P分别为0.000 4、0.000 3、0.002 7、0.000 1）。

图1　2组CDKN2A、CDKN2B、VEGF和MEF2AmRNA表达Fig.1 The mRNA expressions of CDKN2A，CDKN2B，VEGFand MEF2Ain 2 groups

3　讨论

冠心病是目前影响人类健康的重大疾病之一，具有高发病率和高致死率，至今仍未明确其发生的病理学及生理学分子机制。近年来在基因组学领域出现的先进技术（如全基因组关联研究），使得全基因组分析CHD的致病基因成为可能［10］。众多遗传学研究发现，9号染色体p21区（约51 kb长度）与CHD的患病风险有显著相关性。研究［11］显示，CDKN2A和CDKN2B基因即位于此区间附近；另外，MEF2A和VEGF基因的突变也与CHD发病相关。在众多报道中，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF这4个基因的基因多态性（如单核苷酸多态性）是主要的关注点，而关于这4个基因的表达水平在CHD患者及健康人之间存在差异已得到科学论证，但其表达水平是否有种族差异、地域差异、量的差异并没有得到相应的关注［12］。

本研究中，我们发现在CHD患者血液有核细胞中，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表达下降，且与正常对照组相比有统计学差异；同时在血清中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF蛋白含量也显著下降。CDKN2A和CDKN2B是细胞周期调节蛋白，位于9p21区上游大约115 kb处，已经证明这2个基因可能是CHD敏感基因区基因，其表达可能与CHD的易感相关。MEF2A基因属于肌细胞增强因子2家族成员，可能参与血管发生，并对血管形态形成具有重要作用［13］，可能是CAD的易感基因之一，能够通过其他基因为中介间接参与细胞周期调节［14］。VEGF是血管发生、增殖、形成最重要的调节因子，能够通过清除基质、促进内皮细胞移动和内皮细胞出芽，从而诱导胶原酶分泌，启动血管发生，对于CHD的发生有着重要作用［15］。本研究发现，在CHD患者血细胞中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA表达下降，而且表达水平与健康者比较差异极其显著，说明血细胞内CHD相关基因CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的低表达是CHD患者的特征。通过ELISA检测发现，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF蛋白含量在CHD患者血浆中显著下降，且VEGF蛋白的表达下降与其他报道结果一致［8］。CDKN2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF蛋白在CHD组患者表达显著低于正常对照组，与其mRNA检测结果一致。

综上所述，我们发现在CHD患者血细胞与血浆中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA以及蛋白含量较健康者显著降低，这是CHD的重要特征，可以作为筛查CHD患者的一个重要指标。这4种蛋白在血浆中的含量降低是CHD发病的结果还是其发病的诱因，以及其中的分子机制至今仍不清楚，仍需进一步研究。

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（编辑陈姜）

Correlationof CDKN2A，CDKN2B，MEF2Aand VEGFGene Expressionsand Coronary Heart Disease

DINGXiafeng，HUShenjiang
（Departmentof Cardio1ogy，The First Affi1iated Hospita1，Schoo1of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou310003，China）

AbstractObjective To exp1ore the re1ationship between coronary heart disease（CHD）and expressions of cyc1in-depedent kinase inhibitor 2A （CDK2A），CDK2B，myocyte enhancer factor 2A（MEF2A）and vascu1ar endothe1ia1 growth factor（VEGF）genes.Methods A tota1 of 154 CHD patients（CHD group）and 123 hea1thy contro1 cases（contro1 group）were enro11ed in the study. A11 b1ood samp1es from patients and contro1 cases were centrifuged for serum co11ection，and the RNA was extracted after red ce11 1ysis. The gene expressions and protein 1eve1s were detected by qua1itative rea1-time PCR（qRT-PCR）and enzyme-1inked immunosorbent assay（ELSIA）. Results Expressions ofCDKN2A，CDKN2B，MEF2A and VEGF mRNA（0.0115±0.0021，0.0033±0.0004，0.3026±0.0356and0.0221±0.0042，respective1y）inb1oodce11sofCHDpatientsweresignificant1y 1ower than those of contro1 cases（0.048 4±0.0156，0.007 1±0.001 2，0.823 0±0.075 1 and 0.052 7±0.001 3，P ＜ 0.05）. Meanwhi1e，serum concentrations of CDKN2A，CDKN2B，MEF2A and VEGF（121.60±7.96，65.07±5.42，6.51±0.83 and 19.41±1.62 μg/mL，respective1y）of CHD patients were a1so 1ower than those of contro1 cases（236.90±29.13，155.70±22.52，15.96±2.86 and 39.87±4.54 μg/mL，P ＜ 0.05）. Conclusion CHDpatientshad1owerexpressionofCDKN2A，CDKN2B，MEF2A andVEGF thanhea1thypeop1e

Keywordscoronary heart disease；cyc1in-depedent kinase inhibitor 2A；cyc1in-depedent kinase inhibitor 2B；myocyte enhancer factor 2A；vascu1ar endothe1ia1 growth factor

中图分类号R743

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）06-0550-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.018

作者简介：丁夏峰（1979 -），女，主治医师，硕士研究生.

通信作者：胡申江，E-mai1：dxfjy@163.com

收稿日期：2015-08-28