利用苹果渣发酵制备生物腐植酸的工艺研究

孙建国　李运华　王晓彬　李振

摘 要：通过单因素发酵实验，以苹果渣为发酵基质，开展发酵制备生物腐植酸工艺研究。研究结果表明：复合微生物菌剂接种量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，发酵时间20～25 d，黄腐酸含量达22%，活菌含量5.6亿/g，为生物腐植酸规模化生产提供技术参考。

关键词：苹果渣；黄腐酸

中图分类号：TQ92 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）02-0166-03

生物腐植酸（黄腐酸）是由富含纤维素、木质素的植物残体及辅助材料，经多种微生物在一定条件下发酵转化而成。产品活性成分多，含有大量功能菌剂，具有改良土壤、增进肥效、调节作物生长、提高作物抗逆性和改善作物品质等特点。该研究以苹果渣为原料，进行微生物发酵生产黄腐酸的工艺研究，为其规模化处置提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 发酵基质

以苹果渣为发酵基质，来自果汁加工厂。苹果渣中主要成分含量，见表1。

1.1.2 接种剂

是由木霉M21、放线菌F07、地衣芽孢杆菌X33、酵母菌J05组成的复合生物菌剂，有效活菌数≥100亿/g，亳州市恒顺生态科技有限公司提供。

1.1.3 仪器设备

超净工作台，蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，721分光光度计，光学显微镜，真空干燥箱等。

1.2 实驗设计

1.2.1 生物菌剂接种量对发酵过程的影响

实验设四个处理，两次重复。T0为对照处理，处理T1、T2、T3生物菌剂接种量分别为3%、5%、7%。各处理物料含水率50%，尿素添加量2%。

1.2.2 尿素添加量对发酵过程的影响

实验设四个处理，两次重复。T0为对照处理，处理T1、T2、T3尿素添加量分别为1%、2%、3%。各处理物料含水率50%，生物菌剂接种量3%。

1.2.3 物料含水率对发酵过程的影响

实验设四个处理，两次重复，处理T1、T2、T3、T4物料含水率分别为40%、50%、60%、70%。各处理生物菌剂接种量3%，尿素添加量2%。

1.2.4 发酵时间对发酵过程的影响

实验设四个处理，两次重复。

T1：发酵时间15 d；

T2：发酵时间20 d；

T3：发酵时间25 d；

T4发酵时间30 d。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 含水率、有效活菌数的测定

含水率、有效活菌数按照NY/T798-2004复合微生物肥料标准方法测定。

1.3.2 温度测定

在堆肥中心下层、中层和上层放置3支温度计，于每天上午9：00和下午16：00记录堆体温度，取其算术平均值。

1.3.3 黄腐酸含量测定

称取0.2 g试样于250 ml锥形瓶中，加入70 ml水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加热溶解30 min，并经常搅动，取出锥形瓶，冷却后将溶液及残渣全部转入100 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用中速滤纸过滤，弃去最初的部分滤液。

而后，准确吸取上述滤液5 ml于250 ml锥心瓶中，加入C（K2Cr2O7）=4.8 mol/l重铬酸钾溶液5 ml，缓慢加入浓硫酸15 ml，于沸水浴中加热氧化30 min。

最后，将氧化后的溶液从水浴上取下，冷却至室温，加入70 ml水，3滴邻菲罗琳指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液由橙色经绿色转变为砖红色为终点。按下式计算出黄腐酸含量：

式中：V0为滴定空白试管所消耗的硫酸亚铁体积，ml；

V为滴定样品试管所消耗的硫酸亚铁体积，ml；

N为硫酸亚铁标准溶液的摩尔浓度，mol/l；

0.003为碳的毫克重量，g；

a为样品溶液滴定的体积，ml；

b为滴定时所吸取的样品溶液的体积，ml；

G为配制样品溶液时所加入的样品质量，g；

C为黄腐酸的含碳比（一般取为0.5）。

2 结果与分析

2.1 生物菌剂接种量对发酵过程的影响

2.1.1 发酵过程温度与黄腐酸含量变化

生物菌剂接种量对发酵温度的变化，如图1所示，从数据变化可以看出，各处理温度变化均高于对照。随着菌剂接种量的增加，温度增幅最大，T1、T2、T3处理最高温度分别为46.5 ℃、48.2 ℃、50 ℃，处理T3发酵温度增幅最大。不同生物菌剂接种量黄腐酸含量变化，如图2所示，处理T1、T2、T3发酵后黄腐酸含量均高于对照，分别为15%、18.4%、19.2%，处理T3黄腐酸含量最高。

2.1.2 发酵前后有效活菌数变化

生物菌剂接种量对发酵前后有效活菌数的影响，见表2，从表发酵前后有效活菌数变化，反映随着菌剂接种量增加，菌株利用物料速度加快，活菌数增幅更快更多，物料分解效率越高。

通过上述实验结果得出，随着菌剂接种量增加，菌剂生长加快，物料营养很快被消耗，产热促进温度上升，提升物料的分解效率，促使黄腐酸含量与有效活菌数快速增长。但是，处理T2、T3间数据差异不显著，考虑到成本因素，菌剂最佳接种量5%～7%。

2.2 尿素添加量对发酵过程的影响

2.2.1 发酵过程温度与黄腐酸含量变化

有机物料发酵CN比一般在20～30较为合适，苹果渣CN比52，有机碳含量较高，氮含量不足，影响菌剂生长，不利于物料发酵。通过添加尿素，增加氮含量，降低CN比，促进发酵进程。处理T1、T2、T3的CN比分别为34、25、20。尿素添加量对发酵温度的变化如图3所示，不同尿素添加量黄腐酸含量的变化如图4所示，通过图3、图4数据变化可以看出，随着尿素含量增加，温度增幅愈大，黄腐酸含量增长越多。其中，处理T2、T3效果最佳。

2.2.2 发酵前后有效活菌数变化

尿素添加量对发酵前后有效活菌数的影响，见表3，从表数据可以看出，随着尿素添加量的增加，活菌数增长迅速，合适的CN比可以促进菌株迅速繁殖，加快发酵进程。

上述实验结果表明，物料发酵较适CN比20-30，即尿素添加量2%～3%，物料发酵进程加快，黄腐酸与活菌数含量最高。

2.3 物料含水率对发酵过程的影响

2.3.1 发酵过程温度变化

无聊含水率对发酵温度的变化如图5所示，观察图5各处理发酵温度变化，处理T1、T2最高温度分别为49.5 ℃、49 ℃，说明40%、50%含水率比较有利物料发酵。处理T3、T4温度增幅小，原因是含水率过高，不利于氧气供给，影响了菌种生长，物料分解率下降，产热少。

2.3.2 发酵过程黄腐酸含量与活菌数变化

无聊含水率对黄腐酸含量的影响，如图6所示，看图6黄腐酸含量变化，各处理黄腐酸含量分别为16%、16.4%、13.8%、10.2%，处理T1、T2黄腐酸含量最高。发酵前后的活菌数变化，见表4，处理T1、T2发酵后活菌数最高，分别为4.18亿/g、4.25亿/g。

综上实验结果表明，生物发酵腐植酸较适含水率40%、50%，其中50%含水率的黄腐酸含量提前4～5d达到最高值，物料最佳含水率50%。

2.4 发酵时间对发酵过程的影响

根据上述实验结果，苹果渣制备生物腐植酸发酵参数为：复合生物菌剂添加量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%。采用上述工藝参数，研究不同发酵时间黄腐酸与活菌含量变化。

2.4.1 发酵过程温度变化

有机物料发酵分为发热、中高温与降温、腐熟保肥阶段。发酵时间对发酵温度的变化，如图7所示，各处理发酵最高温度约50℃，无明显区别，处理图T1、T2因发酵时间短，缺少降温阶段的腐解。

2.4.2 发酵过程黄腐酸含量变化

从温度变化来看，第11～17 d是发酵中高温阶段，从发酵18 d后，进入降温腐熟保肥阶段，即腐植酸累积阶段。发酵时间对黄腐酸含量的影响，如图8所示，发酵时间20 d，黄腐酸含量达到最高22%。

2.4.3 发酵前后活菌数变化

发酵时间对发酵前后有效活菌数的影响，见表5，发酵15 d，物料活菌数低于发酵20、25、30 d，后三者活菌数差异不显著。

综上所述，发酵13天，物料温度达到最高，发酵18天后进入降温腐熟保肥阶段，即腐植酸累积期，考虑到肥效、黄腐酸与活菌含量因素，最佳发酵时间20～25 d。

3 结 语

利用苹果渣发酵制取生物腐植酸，是一个极其复杂的反应过程。微生物的生长繁殖速度，直接决定了物料腐解程度，从而影响生物腐植酸生成的数量与质量。因此，选择创造最佳的微生物生长环境，探求最优生长因子，是影响发酵好坏的重要因素。研究结果表明，发酵制备生物腐植酸工艺参数为：复合微生物菌剂接种量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，发酵时间20～25 d，黄腐酸含量达22%，活菌含量5.6亿/g。

参考文献：

[1] 沈玉龙，曹文华.发酵法黄腐酸复混肥的开发与应用[J].化工矿物与加 工，2004，（2）.

[2] 司小明.发酵黄腐酸的分离提取及其对植物生理的影响[D].西安：西北 大学，2005.

[3] 陈松，丁立孝，张莉，等.发酵苹果渣生产蛋白饲料的混合菌种筛选[J].食 品与发酵工业，2008，（2）.