陇东绒山羊重要功能基因SNPS研究报告

高宪儒 ， 张建军

(1.庆阳市畜牧技术推广中心，甘肃，庆阳，745000；2.甘肃省畜牧兽医研究所)

陇东绒山羊重要功能基因SNPS研究报告

高宪儒1， 张建军2,*

(1.庆阳市畜牧技术推广中心，甘肃，庆阳，745000；2.甘肃省畜牧兽医研究所)

摘要：以陇东绒山羊为研究对象，采用PCR-SSCP，DNA测序技术，序列分析，最小二乘方差分析，研究了陇东绒山羊重要经济性状候选基因的SNPS与经济性能的关系，寻找可用于辅助选择的分子标记。筛选确定了影响陇东绒山羊生长发育、产绒量、绒细度和产羔率的优势基因型；制定了陇东绒山羊分子育种技术流程；项目的实施，产生了显著的社会效益和经济效益。

关键词：陇东绒山羊；功能基因；遗传变异；经济性状

陇东绒山羊是根据市场需要和陇东地区自然经济条件，于20世纪70年代引入辽宁绒山羊种公羊为父本，以陇东黄土高原的华池、环县、合水、庆阳等当地黑山羊为母本，以提高产绒性能为目的，采取简单育成杂交，历经杂交改良，横交固定和选育提高三个发展阶段经过30年培育而成的具有典型地域适应性的绒山羊品种。因其遗传性能稳定、繁殖性能强、肉质细嫩、产绒性状优良等特质，深受当地养殖农户的青睐，是陇东及周边地区养羊业的主导品种。但目前，陇东绒山羊的选育及其产品的开发，仍停留在传统育种阶段，而经济性状属于微效多基因控制的数量性状，遗传力较低，利用常规的表型选择，会遇到选择效率低、准确性差、世代间隔长、遗传进展缓慢等问题，这对优质高效绒山羊品种的培育将产生不利影响。

因此，本研究利用现代生物技术和传统育种相结合的方法，对与陇东绒山羊生长发育、产羔、产绒等经济性状相关的候选基因进行系统研究，筛选确定其SNP位点，探讨群体遗传结构、遗传多态性及其与经济性状的关联性，旨在揭示影响陇东绒山羊经济性状的重要功能基因的分子遗传特征，为经济性状的高效QTL选育、分子标记辅助选择及基础数据库的建立、种质资源的保存及利用提供分子遗传学依据，现就研究情况报告如下。

1材料与方法

1.1材料

静脉采集华池县悦乐绒山羊繁育基地和环县惠农绒山羊繁育中心陇东绒山羊血样6 mL/只，ACD抗凝，置于采样箱带回实验室，-20 ℃保存，以备基因组DNA的提取。测定陇东绒山羊群体不同月龄的体重、体高、体长、胸围等生长发育指标及产绒量，采集绒毛样品，进行绒长度、绒细度等指标检测，建立陇东绒山羊重要经济性状基础数据库。

1.2方法

1.2.1技术路线针对陇东绒山羊育种中迫切需要解决的优质、高产等问题，以绒山羊重要经济性状为研究对象，综合应用分子遗传学，生物化学、基因组学等多学科交叉的手段，研究与绒山羊经济性状相关的功能基因的遗传学信息基础，为解决陇东绒山羊优良品种培育中的重大理论和技术问题提供创新性研究成果，下图为技术路线图。

图1　功能基因研究路线图

1.2.2DNA分子标记方法利用PCR-SSCP技术、DNA测序技术等进行陇东绒山羊重要经济性状功能基因SNP的检测。

1.2.3统计分析

(1)基因频率和基因型频率

式中i表示纯合等位基因型个体，j1…n表示与i共显性的第n个基因型个体，N为样本总数

(2)相关性分析，根据最小二乘线性模型，考虑到试验动物生长环境相同，测定月龄一致，性别和基因型可能是影响生长发育性状的主要因素，故建立如下模型：

Yijk =μ+Sexi+Genotypej+ Sexi×Genotypej+eijk其中：yijkm 为个体表型记录；μ为群体平均值；Sexi为性别龄效应；Genotypej为基因型效应；Sexi×Genotypej性别与基因型的互作效应，eijk为随机误差。

根据上述模型，运用SPSS 11.5 软件包中的GLM(General Linear Model)程序进行统计分析。

2主要研究成果

2.1影响陇东绒山羊生长发育性状的功能基因

据报道，生长激素基因(GH)、双肌臀基因(CLPG)瘦素基因(Leptin)、肌肉抑制素基因(MSTN)等与动物机体生长、生殖系统发育、产肉性能等密切相关。本研究发现，陇东绒山羊GH基因SNP与其产绒性状及繁殖性状无显著相关(P>0.05)，但与生长发育性状呈显著相关(P<0.05)。在外显子4区域1450 bp处发生C→T 的单碱基突变(见图2)。从6月龄重、周岁重、体长和胸围等早期生长发育指标来看(见表1)，HH、GG、GH三种基因型间存在显著差异(P<0.05)，且以HH型最高。因此，HH型可以作为影响陇东绒山羊早期生长发育性状的有利基因型进行标记辅助选择。

图2　GH基因扩增位点不同基因型测序图

注：同一列具有不同字母肩注者差异显著(P<0.05)。

2.2影响陇东绒山羊产绒性状的功能基因

根据目前的研究成果，影响山羊产绒性状的重要功能基因有褪黑激素(MEL)、褪黑激素受体( MTNR)、催乳素(PRL)、胰岛素生长因子(IGF-I)、乳表皮生长因子(EGF)、角质化细胞生长因子(KGF)等，它们主要通过旁分泌和自分泌方式协同参与毛发周期调控，从而影响产绒性状的表达。本研究对陇东绒山羊MTNR1b基因部分编码区序列进行了多态性分析，发现了两处突变，分别为D00476:g. 663 bp G >A和584 C>T，产生了CC、DD、CD 3种基因型，且CC型基因型频率最高。最小二乘法分析表明(见表2)，MTNR1b基因多态性对产绒量和绒细度有显著影响(P<0.05)，对绒长度无显著影响(P>0.05)。产绒量，3种基因型间存在显著性差异(P<0.05)，从大到小依次为CC型、CD型、DD型；绒细度，CC型与CD型间无显著差异(P<0.05)，但都显著高于DD型(P<0.05)。根据上述结果，推测MTNR1b基因可能影响陇东绒山羊产绒性状的重要功能基因之一，CC型可以作为标记基因型。

表2　不同基因型与陇东绒山羊产绒性状的相关性分析　 (g，cm，μm)

注：同一列具有不同字母肩注者差异显著(P< 0.05)。

2.3影响陇东绒山羊繁殖性状的功能基因

GnRHR通过与定位于垂体促性腺细胞膜上的GnRHR结合，可以促进垂体前叶合成和分泌促卵泡素和促黄体素，进而调控性腺的功能，包括激素合成与配子生成。本研究结果表明，GnRHR基因SNP与陇东绒山羊产羔数和羔羊初生重具有相关性。GnRHR基因外显子1存在多态性，在696 bp处发生了G→C的突变和735 bp处碱基 A的缺失，产生了E、F 2个等位基因和EE、EF 2种基因型。根据繁殖记录，对陇东绒山羊产羔数和羔羊初生重进行跟踪记录。相关性分析表明，不同基因型对产羔数有显著影响(P<0.05)，但对羔羊初生重无显著影响(P>0.05)。EE型个体平均产羔数为1.28，比EF型个体平均产羔数提高了24.3%(见表3)。

表3　不同基因型与陇东绒山羊产绒性状的相关性分析 　 g，个

注：同一列具有不同字母肩注者差异显著(P < 0.05)。

2.4建立了QTL基因型多点联合推断方法

山羊的生长发育、繁殖、产绒等许多经济性状都是由多基因控制的数量性状，现代分子标记技术为实现控制数量性状基因的准确选择提供了有效的技术手段，但大多数分子标记辅助选择实践仅是对标记基因型的选择，而非直接对QTL基因型进行选择。利用QTL 定位获得与上述经济性状紧密连锁的分子标记以及相关基因，提高QTL定位的准确性和精确性，是开展遗传育种工作的重要手段和有效途径。

因此，本研究在四向杂交设计的基础上，结合贝叶斯理论和隐马尔可夫链原理，根据数量遗传学原理和遗传多态性研究成果，提出了一种用于标记辅助选择育种中QTL基因型的多点联合推断方法，旨在应用生物学技术研究影响陇东绒山羊重要经济性状的分子遗传原理。

2.5制定了陇东绒山羊分子育种技术流程

陇东绒山羊主要从表现型和基因型两方面去考虑，选择确定亲本。

图3育种技术流程

3经济社会效益

通过项目的实施，利用分子标记技术优化了群体结构，选育出了体大型、绒多型、绒细型、羔多型群体，累计选育5万多只，整体上提高了陇东绒山羊的个体品质，同时降低了饲养成本。项目总经济效益623.7万元 ，年经济效益207万元，单位规模新增纯收益 198元/只，推广投资年均收益率4.16元/元。陇东绒山羊个体经济性能提高后，即可减少绒山羊存栏量，减少饲草料压力，保护了环境，从而产生具大的生态效益和社会效益，同时，项目技术得到当地政府的肯定和饲养户的大力支持，具有良好的推广和应用前景。

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Study on Key Function Genes SNPS of Longdong Cashmere Goat

GAO Xian-Ru1， ZHANG Jjian-Jun2*

(1.QingyangCityAnimalHusbandryTechnologyPromotionCenter,QingyangGansu745000；2.GansuInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine)

Abstract:The association between SNPs of key economic traits candidate gene and the economic traits of Longdong cashmere goats were analyzed by PCR-SSCP, DNA sequencing, Least square analysis of variance and general linear model and the aims were to look for the molecular marker assisted selection. The dominant genotypes that affected Longdong cashmere goat growth, cashmere yield, cashmere fineness and lambing rate were determined, and the procedures of Longdong cashmere goat molecule breeding were made. There had been significantly social benefits and economic benefits after implementing the project.

Key words:Longdong cashmere goat; function genes; genetic variation; economic traits

[收稿日期]2015-10-18

[基金项目]甘肃省科技厅资助项目技术研究与开发专项计划(1004TCYL033)

[作者简介]高宪儒(1964-)，男，本科，高级畜牧师。主要从事动物生产及技术推广工作。E-mail: 2649076045@qq.com *[通信作者]张建军，副研究员，主要从事动物系统生产研究与示范。E-mail:jjzh1978@163.com

[中图分类号]S 852.651

[文献标识码]A

[文章编号]1004-6704(2016)02-0016-04