酶法制备马里兰烟浸膏的工艺优化及其香味成分分析

许春平，曾 颖，申屠洪钎，郑 凯

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.四川中烟工业有限责任公司技术研发中心，四川成都610060；3.河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂，河南许昌461000）

酶法制备马里兰烟浸膏的工艺优化及其香味成分分析

许春平1，曾 颖1，申屠洪钎2，郑 凯3＊

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.四川中烟工业有限责任公司技术研发中心，四川成都610060；3.河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂，河南许昌461000）

为获得优质马里兰烟浸膏，采用酶法制备浸膏，并对制备工艺进行优化得到最佳提取条件，最后对最优条件下制备的浸膏进行香味成分分析，并与非酶解浸膏进行对比。结果表明：马里兰烟浸膏的最优制备工艺为果胶酶∶纤维素酶＝1∶1，pH为5，温度为48℃，液料比为9∶1，该条件下，浸膏得率为31.03%。与非酶方法相比，采用酶解的方法浸膏得率提高13.53%；酶解方法与非酶方法相比，马里兰烟浸膏的挥发性香味物质种类从16种增加到23种；香味成分中如苯甲醇、苯乙酸、β－大马烯酮含量增加，分别提高27.64%，69.68%和97.35%；且浸膏中不再检出烟碱。

马里兰烟；浸膏；酶法；香味成分；GC／MS

马里兰烟是一种淡色晾烟，填充能力强，阴燃性好，具有特征香气的烟草类型［1－2］。其焦油和烟碱含量较低，香气浓郁，吸味纯正，既是混合型卷烟的原料之一，也是多种烟制品的调味型原料［3］。近年来，随着马里兰烟的种植增加，相应废次烟叶的量也有所上升，如何利用废次马里兰烟烟叶已经成为一个急待解决的问题。

植物细胞壁主要由纤维素和果胶质组成，其在植物浸膏制备过程中阻碍其中香味物质等向细胞外扩散，如用相应的酶将其水解，能够提高浸膏得率，且由于酶具有专一性，不会破坏浸膏中原有的成分［4］。酶解提取天然组分的方法在植物中应用较多，刘晓光等［5］运用酶解法提取山楂果黄酮，而且保证了黄酮类化合物的活性。庞登红等［6］应用蛋白酶处理制备出特色浸膏，其蛋白质含量较低，小分子香味成分增加。目前，针对香料烟和烤烟浸膏的研究较多，且大都采用物理制备的方法［6－7］。马里兰烟浸膏以及酶解制备的研究较少，应用生物技术从废次马里兰烟烟叶制备马里兰烟浸膏，作为一种烟用香料，既可以丰富卷烟香气类型，也可以变废为宝。试验以马里兰烟烟叶为原料，酶解辅助浸膏的制备，增加浸膏的得率，对其工艺进行优化，并对未酶解和酶解制备浸膏的挥发性成分进行GC／MS对比分析，进一步说明酶解对浸膏制备的作用，以及其在卷烟加香中的可行性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烟叶：废次马里兰烟烟叶（Md609，产地：湖北宜昌）。

试剂：果胶酶200 000U／g（江苏瑞阳生物科技有限公司），纤维素酶500 000U／g（江苏瑞阳生物科技有限公司），半纤维素酶200 000U／g（江苏瑞阳生物科技有限公司），二氯甲烷（天津市富宇精细化工有限公司），分析纯。

仪器：Q－100A3高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司），BS200S型电子分析天平（德国赛多利斯公司），RE－52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），6890／5973气相色谱／质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 原料预处理

将马里兰烟于50℃烘箱中烘干水分，将干燥后的烟叶打粉，放置于干燥器中备用。

1.3 马里兰烟烟叶浸膏制备及得率计算

马里兰烟烟叶浸膏制备工艺根据赵铭钦等［7］的方法进行改进。具体流程：取50g马里兰烟烟叶末，按比例加入水，搅拌均匀，调pH后再加入酶，水浴处理4h，然后3 000r／min离心10min，取上清液用1mol／L H2SO4将pH值调到3.0，酸化90min，离心取上清，旋转蒸发浓缩，再加入3倍体积乙醇进行沉淀过滤，最后回收乙醇，得到浸膏，将浸膏放入40℃烘箱中烘干其中溶剂，3次称量结果不变，则为浸膏干重（图1）。

浸膏得率＝浸膏干重／烟末质量×100%

图1 马里兰烟浸膏制备工艺流程Fig.1 Process flow diagram of Maryland tobacco concrete preparation

1.4 酶法制备马里兰烟浸膏的单因素试验

试验对酶种类、加酶量、液料比、pH、提取温度、提取时间以浸膏得率为试验指标进行单因素试验。

酶的初筛：试验因素中酶种类取空白（非酶方法）、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶∶纤维素酶＝1∶1、果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶＝1∶1∶1共6个加酶条件，按加酶量4%，液料比10∶1（mL∶g，下同），pH 5.5，提取4h进行试验，得出得率最高的酶种类。

液料比、pH、提取温度、提取时间和加酶量5个因素进行试验时，以果胶酶∶纤维素酶＝1∶1，根据预试验结果设计各因素水平分别为液料比6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，pH为4.0、5.0、6.0和7.0，提取温度为30℃、40℃、50℃和60℃，提取时间为1h、2h、4h和8h，加酶量为3%、4%、5%和6%，其他试验条件同上，从而确定最优条件。

1.5 酶法制备马里兰烟浸膏的响应面优化试验

根据单因素试验结果，选取pH、温度和液料比3个对浸膏得率有显著影响的因素，利用Design Expert软件根据响应面Box－Behnken Design （BBD）方法设计3因素3水平试验（表1），优化试验条件。

表1 酶法制备马里兰烟烟叶浸膏的响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology of preparation process of Maryland tobacco concrete by enzyme method

1.6 回归方程的建立

利用Design Expert软件对响应面试验中的响应值进行二元回归拟合分析与方差分析，建立回归方程。

1.7 马里兰烟烟叶粉及制备浸膏的GC－MS分析

取未酶解的马里兰烟烟叶浸膏8.57g（含水率29%）放入同时蒸馏萃取样品烧瓶中，用100mL水溶解，加入10g氯化钠，取50mL二氯甲烷为溶剂到另一小瓶进行同时蒸馏萃取，萃取时间为2.5h，萃取结束后，将装有二氯甲烷的小瓶中加入3～5g无水硫酸钠静置12h，过滤，加入1mL的内标物（0.821 1mg／mL乙酸苯乙酯），将溶液浓缩至1～2mL，过膜（0.22μm），转移到色谱瓶中，记为浸膏1；取酶解的（果胶酶∶纤维素酶＝1∶1）马里兰烟浸膏样品10.29g（含水率为28%），方法同上，记为浸膏2，用GC－MS对其进行检测分析。将其中匹配度大于80%的化合物列于表中，并计算各成分含量。对其中所含挥发性香味物质进行比较［9］。

GC－MS分析条件［8］：色谱柱，HP－5MS毛细管柱（30m×0.25mm×1μm）；进样口温度：280℃，程序升温：初始温度50℃维持2min，然后以2℃／min的速度升至280℃，在280℃保持117min；载气：He，1mL／min；分流比3∶1；MS分析条件：电离方式EI源，传输线温度280℃，电离能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度160℃，质量扫描范围45～500aum；检索谱库：NIST05库。用乙酸苯乙酯作为内标对各种物质进行定量。

1.8 数据处理

组间差异比较采用IBM SPSS Statistics 21.0软件的S－N－K检验完成，显著性水平为P＜0.05，相同字母之间表示差异不显著，不同字母之间表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同因素对马里兰烟烟叶浸膏得率的影响

2.1.1 酶种类 从表2可知，添加酶能提高马里兰烟烟叶浸膏的得率。而不同酶对浸膏得率的影响也不同，其中单独使用半纤维素酶对浸膏的得率最小，果胶酶∶纤维素酶为1∶1的浸膏得率最高。原因可能是半纤维素酶对于细胞壁的降解效果不如果胶酶和纤维素酶，故最后得到的浸膏较少。

2.1.2 加酶量 从图2a可知，当果胶酶∶纤维素酶＝1∶1加入时，加酶量的增加能提高浸膏得率，但并不是一直呈上升趋势，加酶量达4%后，再增加加酶量对浸膏得率的增加不显著，选取4%的加酶量既能获得更大的得率也能节约成本。

表2 不同酶种类的马里兰烟烟叶浸膏得率Table 2 Maryland tobacco concrete yield made by different enzyme types

2.1.3 液料比 从图2b可知，随着液料比的增大，浸膏得率显著增大，但是液料比过大反而不利于浸膏的制备，在液料比为10∶1左右时得率更高，液料比为12∶1时可能由于稀释作用，导致得率有所降低。

2.1.4 pH从图2c可知，pH过高或过低都对浸膏的制备有不利影响，在pH＝5左右时，浸膏的得率最高。结合酶解过程分析，原因可能是因为pH对酶活产生较大影响，从而间接影响浸膏的制备。

2.1.5 提取温度 从图2d可知，提取温度对浸膏得率的影响与pH相似，呈现出抛物线形，在50℃左右达最佳，原因是受到酶活性的影响，在50℃时，酶活较高，有利于烟叶细胞内物质的溶出；此外，温度的增加能增大物质的扩散速度，达到一定的温度时，再增加温度对扩散速度的影响较小。

图2 不同加酶量、液料比、pH、提取温度和提取时间的马里兰烟烟叶浸膏得率Fig.2 Yield of Maryland tobacco concrete with different enzyme concentration，liquid－solid ratio，pH，extraction temperature and time

2.1.6 提取时间 从图2e可知，随着时间的延长，能够得到的浸膏越多，但达到一定的时间后，再增加温度浸膏得率的增加不大。原因可能是时间的延长有利于物料在溶液中充分的溶出、扩散，以及酶解反应的充分进行，从而使浸膏得率增加。

2.2 酶法制备马里兰烟烟叶浸膏的工艺优化

由表3可知，经响应面试验得到马里兰烟浸膏得率的回归方程：

y＝30.85＋3.31A－1.22B－0.65C－0.045AB－ 0.095AC＋0.16BC－5.52A2－3.53B2－2.19C2，对该模型进行方差分析，该模型P＜0.001，为极显著。而失拟项为不显著（P＞0.05），也就是不确定因素对模型的干扰小，而该模型的拟合效果好，可以利用模型对试验结果进行分析及预测。同时，一次项中A、B、C和二次项A2、B2、C2对于浸膏得率的影响极显著，而AB、AC、BC间的交互作用对于得率的影响不显著。

表3 酶法制备马里兰烟烟叶浸膏的响应面试验结果Table 3 Result of response surface mythology of preparation process of Maryland tobacco concrete by enzymatic

由响应面优化方程可以得到最优的试验条件为pH 5.3，温度48.21℃，液料比9.28∶1，在此条件下得到响应值（y）浸膏得率的最大值，预测值为31.51%。为便于操作，设置pH 5，温度为48℃，液料比为9∶1进行试验，从而得到浸膏得率为31.03%，接近于预测值；与上述酶筛选试验中，果胶酶∶纤维素酶＝1∶1、加酶量4%、液料比10∶1、pH5.5、提取4h组进行比较，差异不显著；与酶筛选试验中传统的非酶处理方法相比差异显著，并使浸膏得率增加了13.53%。由此，说明模型的预测可行。

2.3 马里兰烟烟叶浸膏的GC－MS分析

从表4可知，未酶解马里兰烟烟液浸膏（浸膏1）中有挥发性香味成分16种，酶解（浸膏2）的挥发性香味成分增加到23种。制备的未酶解和酶解的马里兰烟烟叶浸膏都含有多种特征挥发性香味成分［1012］，但未检测到烟碱，说明浸膏作为香料进行添加并不会增加配方中烟碱的含量，从而保证卷烟的安全性。

表4 马里兰烟烟叶非酶解浸膏与酶解浸膏的挥发性香味成分Table 4 Volatile flavor components of Maryland tobacco concretes by non－enzymatic and enzymatic hydrolysis μg／g

酶解浸膏有13种挥发性香味成分的量高于未酶解浸膏，其中酶解浸膏中苯甲醇、苯乙酸和β－大马烯酮含量增加，分别提高27.64%，69.68%和97.35%；酶解浸膏的挥发性香味成分中有7种在未酶解浸膏中未检测到，分别是糠醇、丙二酸二乙酯、3－乙酰基吡啶、苯乙酸乙酯、丁位壬内酯、别香橙烯和石竹烯。其中，糠醇具有椰子与焦土豆的香气［13］；丙二酸二乙酯可以作为一种食用香料用于配制梨、苹果、葡萄、樱桃等水果型香精［14］；3－乙酰基吡啶呈花生和坚果似香气，似爆玉米花的香气，有甜味［15］；苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气［16］；丁位壬内酯具有的坚果、牛奶、奶油和椰子样气味［17］。从而使酶解浸膏的香气更加丰富。也进一步说明酶解对于马里兰烟烟叶浸膏的制备有效，可以增加其香味物质的种类和含量。

3 结论

试验采用酶解方法增加马里兰烟烟叶浸膏的得率，通过单因素试验考察酶种类、加酶量、液料比、pH、提取温度和提取时间6个因素对于浸膏得率的影响，从而得出大致规律。再设计响应面试验优化工艺条件，其最佳的制备条件为果胶酶∶纤维素酶＝1∶1，pH 5，温度为48℃，液料比为9∶1，该条件下的马里兰烟烟叶浸膏得率为31.03%，比传统的非酶方法提高13.53%。

对得到的未酶解和酶解（果胶酶∶纤维素酶＝1∶1）的马里兰烟烟叶浸膏分别进行GC－MS分析表明，挥发性香味成分在未酶解浸膏中有16种，酶解浸膏中有23种，酶解制备浸膏与非酶解方法相比挥发性香味成分增加了7种，13种成分的含量有所增加。说明酶解是一种比较好的制备烟草浸膏的方法。

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（责任编辑：孙小岚）

Enzymatic Preparation and Flavor Components Analysis of Maryland Tobacco Concrete

XU Chunping1，ZENG Ying1，SHENTU Hongqian2，ZHENG Kai3＊
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan450002；2.Technical Center of China Tobacco Sichuan Industrial Co.Ltd，Chengdu，Sichuan 610060；3.Xuchang Cigarette Factory，China Tobacco Henan Industrial Co.Ltd，Xuchang，Henan 461000，China）

To obtain the Maryland tobacco concrete with good quality，in this paper，the tobacco concrete was made by enzymatic method，and the extraction procedure was optimized and flavor components of tobacco concrete was analyzed.Results：The optimized conditions included pectinuse∶cellulase＝1∶1，pH 5，temperature 48℃，liquid－solid ratio 9∶1，and the concrete yield reached 31.03%.Compared with the non－enzymatic method，the yield of enzymolysis method was increased by 13.53%.Compared with the non－enzymatic method，the number of volatile flavor compounds prepared by enzymolysis method was increased from 16to 23.The contents of aroma components such as benzyl alcohol，benzeneacetic acid andβ－Damascenone were increased by 27.64%，69.68%and 97.35%，respectively，and no nicotine was detected in the concrete.

Maryland tobacco；concrete；enzymatic method；flavor components；GC／MS

TS49

A

1001－3601（2016）08－0354－0117－05

2015－12－25；2016－07－31修回

郑州市科技局科技攻关项目“利用低次烟叶制备烟用香料的研究”（10PTGG339－2）

许春平（1977－），男，教授，从事烟草生物技术研究。E－mail：c.p，xu＠zzuli.edu.cn

＊通讯作者：E－mail：18822762＠qq.com