星点设计-效应面法优化五味子木脂素的提取工艺

李平， 李小芳，向志云，李培培，周维，罗开沛



星点设计-效应面法优化五味子木脂素的提取工艺

李平， 李小芳，向志云，李培培，周维，罗开沛

［摘要］目的：优选五味子治疗失眠有效部位的提取工艺。方法：采用单因素试验考察回流提取时间、乙醇体积分数、溶剂用量、提取温度、提取次数等对五味子总木脂素含量的影响。在单因素试验基础上选取乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间为考察因素，每个因素设置5个水平，以总木脂素得率为评价指标，利用星点设计-效应面法优选回流提取工艺。结果：五味子治愈失眠有效部位的最佳回流提取工艺为乙醇体积85%、乙醇用量3倍、提取时间49 min、提取次数1次。结论：优选的回流提取工艺简便易行，预测性良好，为五味子后续的剂型开发和工业化生产提供实验依据。

［关键词］五味子；有效部位；总木脂素；星点设计-效应面法

［作者单位］成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

Tel:18428319627 Email:996814977@qq.com.

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五味子具有益气滋肾、生津止渴、宁心安神功效［1］，临床用于治疗心悸、失眠、多梦、津伤口渴、消渴［2］，其改善睡眠的主要有效成分为木脂素类［3］。目前对五味子多糖的研究报道较多，而对其木脂素活性成分的研究报道相对较少。本实验在单因素试验基础上，以总木脂素得率为指标，利用星点设计-效应面法优选五味子治愈失眠的有效部位的回流提取工艺［4］，为后续的剂型开发和工业化生产奠定基础。

1　材料

水浴锅，UV-6000型紫外-可见分光光度计；DZG-6020型真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、BP211D AG型电子天平（德国Satorius）；UPT-I-10T型超纯水器（成都超纯科技有限公司）；DEY-300型摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；SB-5200DT型超声仪（200W，40 KHz；宁波新芝生物科技股份有限公司）。五味子饮片（四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学李敏教授鉴定为五味子科植物五味子Schisandra chinensis.的成熟果实）；五味子乙素对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：Must-14041606）；所用试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取五味子乙素对照品1.9 mg，置于20 mL量瓶中，加95%乙醇使溶解并定容至刻度，即得。

2.1.1 供试品溶液的制备 称取五味子粗粉约2 g，精密称定，置于150 mL烧瓶中，精密加入60%乙醇溶液20 mL，在90 ℃水浴锅内加热回流1 h，滤过，取续滤液，取适量用95%乙醇定容至一定刻度即得。

2.1.2 线性关系考察 利用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，发现在278 nm处有最大吸收［5］。精密吸取对照品溶液1，2，3，4，5 mL，分别置于5 mL量瓶中，各加入95%乙醇并定容至刻度，于278 nm处测定吸光度（A），以A为横坐标，质量浓度为纵坐标，得回归方程Y=8.847X+0.003（r =0.9995），线性范围0.019～0.095 mg.mL-1。

2.1.3 精密度试验 精密量取五味子乙素对照品溶液2 mL，按“2.1.2”项下连续测定6次，结果A的RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液2 mL，分别于0，5，10，15，20，25 h按“2.1.2”项下方法测定，结果A的RSD 为0.95%，表明供试品溶液至少在25 h内基本保持稳定。

2.1.5 重复性试验 取同一份五味子提取液，按“2.1.1”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1.2”项下方法测定，结果总木脂素提取率的RSD为 1.4%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收试验 精密称取已知提取率的同一五味子提取液6份，每份1 mL，各加入已精密量取的五味子乙素对照品溶液1mL，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法测定A，计算平均加样回收率，见表1。

表1 加样回收试验结果

由表可知，平均加样回收率为1.25%。

2.2 单因素试验考察

选取提取时间、提取温度、乙醇体积分数、溶剂用量等为考察因素，每个因素各设5个不同水平，分别称取五味子饮片1 g进行提取工艺考察。

2.2.1 提取时间 规定提取温度90 ℃，乙醇体积分数70%，料液比1:10，选取提取时间为30，60，90，120，150 min的5个水平分别进行考察，结果发现总木脂素对应的A随提取时间的改变而呈现一定的变化，并在150 min时A最低，30 min时A最高。

2.2.2 乙醇体积分数 固定提取温度90 ℃，提取时间30 min，料液比1:10，选取乙醇体积分数为30%，50%，70%，80%，90%的5个水平分别进行考察，结果可知当乙醇体积分数70%时，总木脂素有最大A。2.2.3 溶剂用量 固定提取温度90 ℃，提取时间30 min，乙醇体积分数70%，选取料液比1:10，1:14，1:18，1:22，1:26的5个水平分别进行考察，结果显示当料液比1:10时总木脂素有最大A，之后A随比值的变小而变小，故选择10倍量的溶剂用量。

2.2.4 提取温度 固定提取时间30 min，乙醇体积分数70%，料液比1:10，选取50，60，70，80，90 ℃共5个水平进行考察，结果显示各温度下测得的A变化不大，但当提取温度为90℃时，总木脂素有最大A。

2.3 星点设计试验［6］

在单因素试验基础上，选择提取时间、乙醇体积分数、溶剂用量进行三因素五水平的星点设计，以总木脂素得率为评价指标，利用效应面法优化五味子的提取工艺。因为提取次数为非连续变量，结合预实验和参考文献，将提取次数先暂定为1次。因素水平见表2，试验安排与结果见表3。

表2 五味子有效部位回流提取工艺因素水平

表3 五味子有效部位回流提取工艺星点试验安排

注：15～20号为重复实验，结果用平均值表示。

2.3.1 统计分析 以总木脂素得率为因变量（Y），X1，X2，X3为自变量，采用Design-Expert8软件进行多元线性回归和二项式拟合，拟合模型，多元线性回归：r=0.462，P=0.045＞0.01，模型不能通过检验，模型拟合度不高，预测性也不好，因此不采用线性模型拟合。二项式拟合复相关系数r=0.9372，P＜0.0001，各项方差分析结果见表4。从表4可以看出，各因素中一次项、二次项都具有显著性差异，再次说明具体实验因子对效应值的影响不是简单的线性关系。最后选择二项式拟合模型为成功模型。

表4 五味子回流提取工艺多元二项拟合方程方差分析

2.3.2提取工艺的优化与预测 根据已经确定的方程为模型，固定3个自变量之一为中值，以总木脂素得率为因变量，绘制效应面的三维图，见图1～3，结果得最优工艺条件为提取时间49 min，乙醇体积分数为84.52%，乙醇用量为3.07倍。为便于实际操作，最后将参数确定为加3倍量的85%乙醇提取49 min。

图1 表示乙醇体积分数和提取时间对总木脂素得率的影响

图2 表示乙醇体积分数和用量对总木脂素得率的影响

图3 表示乙醇用量和提取时间对总木脂素得率的影响

2.3.3 验证试验 按优选的工艺条件进行3次验证试验，结果平均得率 30%，与预测值的偏差1.6%，实测值和预测值基本吻合说明建立的数学模型可靠，预测性良好。

3　讨论

研究报道表明五味子木脂素类化合物具有镇静、催眠、抗衰老、抗氧化等药理活性［7］。五味子中木脂素类和挥发油类成分具有缩短潜睡期，改善睡眠作用，还有能抑制肿瘤细胞行为［8］。五味子中木脂素类成分的提取有采用水煎法、乙醚回流提取以及超声提取法［9］。通过预实验证明五味子木脂素类成分适宜用乙醇进行回流提取。利用乙醇对五味子粗粉进行回流提取，操作方便可控，且提取快速，适合工业化生产。

［参考文献］

［1］杨放，袁军.付平五味子的研究概况［J］.华西药学杂志，2003，18（6）:438.

［2］霍艳双，陈晓辉，李康，等.北五味子的镇静催眠作用［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（2）:126.

［3］徐丽华，黄芳，孙萌，等.南北五味子镇静催眠活性部位共有成分的分析［J］.分析化学，2009，37（6）:828.

［4］田振坤，马英丽，吴伦，等.星点设计-效应面法优化北五味子果实提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（23）:29.

［5］李霞，贾晓斌，陈彦，等.五味子提取工艺的优化研究［J］.中国药房，2007，18（6）:425.

［6］文怡静，李小芳，刘玲，等.星点设计-效应面法优化首乌藤微波提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（23）:26.

［7］齐雁辉，赵彩玉.五味子的现代药理作用研究进展［J］.中国医药指南，2011，9（26）:44.

［8］张朝波，柳燕，李林燕.南五味子总木脂素有效部位镇静催眠作用研究［J］.中药药理与临床，2011，27（1）:29.

［9］周玲，王学魁，沙作良.五味子木脂素超声循环提取工艺条件的优化［J］.天津科技大学学报，2012，27（1）:14.

（责任编辑：傅舒）

Optimize the extraction process of Wuweizi lignans by central composite design - response surface methodology

LIPing， LI Xiao-fang， XIANG Zhi-yun， LI Pei-pei， ZHOU Wei， LUO Kai-pei//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: To optimize extraction process of effective parts of Wuweizi for curing insomnia. Method: Singlefactor tests were adopted to investigate effects of extraction time， ethanol concentration， solvent dosage， extraction temperature and extraction times on contents of total lignans in Wuweizi. Based on single factor tests， ethanol concentration， solvent dosage and extraction time were used as factors （five levels for each factor）， then extraction process of effective parts in Wuweizi for curing insomnia was optimized by central composite design-response surface methodology with extraction efficiency of total lignans as evaluation indicator. Result: Optimum extraction process was as follows: extracted 49 min with 3 volumes of 85% ethanol at 90℃，1 time. Conclusion: Optimized extraction process is simple and feasible with good predictability. It can provide experimental evidence for formulations development and industrial production of Wuweizi.

［Key words］Wuweizi； effective parts； total lignans； central composite design-response surface methodology

［中图分类号］R283.6

［文献标识码］A

［文章编号］1674-926X（2016）02-012-03

［作者简介］李 平，在读硕士研究生；研究方向：中药新剂型及中药新技术研究

［通讯作者］李 小芳，女，教授，博士生导师，从事中药新剂型及中药新技术研究

［收稿日期］2015-01-07