兰州黑白花奶牛肾组织细胞系的建立

令世鑫，徐水林，马　伟，马桂兰，马　花，王家敏，马忠仁，乔自林*（.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃兰州730030）



兰州黑白花奶牛肾组织细胞系的建立

令世鑫1，徐水林2，马伟1，马桂兰2，马花1，王家敏1，马忠仁1，乔自林1*
（1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；
2.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃兰州730030）

摘要：目的：通过体细胞分离培养和保存，在细胞水平上保存兰州黑白花奶牛的种质资源。方法：采用胰蛋白酶热消化分离培养兰州黑白花奶牛的肾组织细胞，传代扩大培养后液氮保存，对保存的细胞进行了复苏活力、形态、生长特性、微生物和内外源病毒因子检查。结果：保存的兰州黑白花奶牛肾细胞复苏活力达94%，生长良好，形态以梭形和上皮形为主，生长曲线呈近“S”型，最大增殖浓度3.89×105/ml，倍增时间为27.15 h，无菌、支原体和内外源病毒因子检查为阴性。结论：成功建立了兰州黑白花奶牛肾组织细胞系，使种质资源在细胞水平上得以长期保存。

关键词：兰州黑白花奶牛；肾细胞；种质资源

兰州黑白花奶牛是经过四十多年的杂交选育培育出的一种适应于西北地区环境条件的乳用牛品种，是甘肃省地方牛品种荷斯坦奶牛——甘肃类群的重要组成部分，现为以兰州市花庄奶牛繁殖场为核心的扩繁群以及兰州市城乡结合部的散养分布特征［1，2］。兰州黑白花奶牛育成以后研究主要集中于饲养管理、生产状况和疾病防治等方面，对于种质资源的保存主要是建立纯种群和扩繁群方式，仅通过品种选育实施原位保存方式。在实施国家自然科技资源共享平台项目《畜禽种质资源收集、整理与保存》以来，先后有几百个品种的家养和野生畜禽的种质资源在细胞或基因水平上得到了长期保存。兰州黑白花奶牛是经长期人工培育形成的甘肃地方品种，在体貌特征、生产性能和适应性等方面已形成了品种特征，其种质资源应有多方面的保护措施，为此开展体细胞系的建立和保存工作。

1　材料与方法

1.1材料

兰州黑白花奶牛肾组织采自兰州花庄奶牛繁殖场

出生的新生小牛公母各两头。DMEM（Gibco）、0.2%胰蛋白酶（兰州百灵生物）、胎牛血清（兰州民海生物，添加比例为10%）、DMSO（ThermoFisher）、无菌和支原体检查培养基（北京三药）、Hoechst33258（Sigma）、病毒荧光抗体结合物（VMRD）、病毒检查传代细胞（本室保存）、鸡和豚鼠红细胞等。主要仪器设备有CO2培养箱（Thermo，3111型）、倒置相差显微镜（Olympus，CK40- 32PH型）、荧光倒置相差显微镜（Olympus，IX71型）、液氮罐（乐山东亚）等。

1.2方法

1.2.1组织采集新生小牛刚采集完血液后快速剥去牛皮，从腹部中间纵向切开，将腹腔部分内脏移出使一侧肾脏完全暴露，连包裹的脂肪一起用手摘下，必要时借助器械剪断血管或输尿管，在阴凉处放置10～20 min，使表层脂肪稍微凝固装入自封袋并标记性别，放入装有冻袋的泡沫箱中6 h内带到实验室分离培养细胞。

1.2.2分离细胞和原代培养按文献方法采用胰蛋白酶热消化法分离培养细胞［3］。

1.2.3传代培养和细胞冻存显微镜下原代培养的细胞形成较致密的细胞层时用胰蛋白酶消化按1∶2比例传代培养，此后按1∶3比例传代。第三次传代时扩大培养数量，在对数生长期末期消化后按2.0×106/ml左右密度在液氮中冻存，冻存保护液为10%DMSO+20%胎牛血清+70%DMEM。每个个体的肾细胞冻存30支，每支装量1 ml。

1.2.4细胞鉴定按文献方法检定冻存细胞的活力、形态、生长特征、无菌和支原体以及致细胞病变、血细胞吸附和特异性病毒外源因子［4］。

2　结果

2.1原代培养和传代培养

兰州黑白花奶牛肾组织消化培养的原代细胞分离接种培养48 h可见有细胞贴壁分裂生长，多为梭形和扁平样上皮形细胞簇，换液后细胞生长变快，96 h时大部分视野长成致密单层，以长梭形细胞为主，细胞长势旺盛，致密的细胞层呈流水样走势。原代细胞以1∶2比例传代培养时48 h成很致密单层细胞，此后1∶3比例传代也在48 h成致密单层，如图1。

图1　兰州黑白花奶牛肾细胞形态图（a.原代培养第2天；b.原代培养第96 h；c.第一代48 h；d.复苏后48 h）

2.2细胞冻存

对传代培养第三代的肾细胞在液氮中冻存，四个个体的细胞冻存时的平均密度为2.12×106/ml，平均活力为96.2%。2.3细胞鉴定

2.3.1复苏活力平均复苏活力为94%，比冻存前有所下降。

2.3.2细胞形态复苏后培养48 h时在培养瓶90%以上生长面长满细胞，形态以梭形和扁平上皮形为主，梭形细胞边缘清晰，上皮形细胞边缘模糊成片生长。

2.3.3生长特征兰州黑白花奶牛肾细胞生长曲线呈“S”型，如图2，平均最大增值浓度为3.89×105/ml，倍增时间为27.15 h。

图2　兰州黑白花奶牛肾细胞生长曲线图

2.3.4无菌检查细胞培养48 h的培养基接种到硫乙醇酸盐（37℃）、酪胨琼脂培养基（37℃）和葡萄糖蛋白胨培养基（25℃）中培养7 d均没有菌生长。2.3.5支原体检查细胞培养48 h的培养液接种到支原体液体基和固体培养基上均未检出支原体生长；细胞冻融处理的上清液接种Vero细胞上荧光染色后，只观察到细胞核有蓝色荧光，其它部位没有荧光，如图3。

图3　兰州黑白花奶牛肾细胞支原体检查结果图（a.阳性对照；b.阴性对照；c.样品）

2.3.6内、外源病毒因子检查细胞培养直接观察和血吸附试验细胞形态正常，无血细胞吸附现象；冻融后的上清液接种Vero和MRC- 5细胞培养观察和血凝试验的两种细胞均形态正常，血凝试验为阴性；细胞冻融后的上清液接种牛肾原代细胞用荧光抗体结合物检查牛腹泻病毒（BVDV）和呼肠孤病毒（REO），染色后未呈现特异性荧光，表明细胞没有内外源病毒污染，如图4。

图4　兰州黑白花奶牛肾细胞免疫荧光法检查病毒结果图

3　结论

畜禽种质资源是以物种为单元的遗传多样性资源，是关系到畜牧业可持续发展和生物多样性以及人类社会可持续发展的重要物质基础，也是生态系统的有机组成。动物的体细胞包含物种的全部遗传信息，构建畜禽种质资源细胞库，可实现对种质资源的永久保存［5］。兰州黑白花奶牛是甘肃省优良地方品种，用胰蛋白酶热消化新生小牛肾组织分离培养保存的细胞生长良好，没有内外源微生物污染，使这一重要物种的种质资源在细胞水平上得以保存，也为相关遗传学研究提供理想的生物材料。

参考文献：

［1］赵国琳.甘肃省地方畜禽品种资源［M］.兰州：甘肃科学技术出版社，2013.

［2］孙连科.兰州黑白花奶牛泌乳规律及其分布［J］.甘肃畜牧兽医，1988，（06）：7.

［3］乔自林，令世鑫，冯若飞，等.滩羊肾和耳缘组织细胞的分离培养与鉴定［J］.畜牧与兽医，2012，44（11）：64-66.

［4］魏园园，马忠仁，王家敏，等.PK15细胞的生物学特性和质量评价研究［J］.黑龙江农业科学，2015，（5）：61-65.

［5］中国科学院生物多样性委员会.生物多样性（译）［M］.北京：中国科学技术出版社，1990.

（编辑：高真贞）

中图分类号：S826.89

文献标识码：B

文章编号：1006- 799X（2016）05- 0068- 02

基金项目：兰州市科技计划项目（2006- 2- 59）

作者简介：令世鑫（1966-），男，甘肃通渭人，工程师，主要从事家养动物种质资源保护利用工作。

通讯作者：乔自林（1976-），男，甘肃永靖人，高级实验师，主要从事动物细胞培养技术工作。