母胎界面抗磷脂抗体-补体激活机制与自发性早产关系的研究*

杜佩英刘宝玲李孜



母胎界面抗磷脂抗体-补体激活机制与自发性早产关系的研究*

杜佩英①刘宝玲①李孜①

【摘要】目的：探讨外周血、胎盘组织中抗磷脂抗体（APA）水平和补体激活机制与自发性早产（SPB）的关系。方法：选取2015年2月-2016年2月本院收治的60例早产分娩产妇作为病例组，另择同期60例正常分娩产妇作为对照组，使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定两组产妇外周血、胎盘组织中抗心磷脂抗体（ACA）、狼疮样抗凝物（LA）和抗β2GPⅠ抗体的水平，采用免疫组化方法检测胎盘组织中的补体系统（包括C3、C5、IgG和IgM）水平。结果：病例组胎盘组织中ACA、LA和抗β2GPⅠ抗体水平较外周血更为灵敏，两者比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；病例组胎盘组织中C3、C5、IgG和IgM沉积极为显著，而对照组基本无沉积，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：胎盘组织中的ACA、LA和抗β2GPⅠ抗体指标更能反映SPB病情，补体系统激活与APA诱发SPB过程密切相关。

【关键词】早产； 抗磷脂抗体； 补体系统

①广州市番禺区何贤纪念医院 广东 广州 511400

Medical Innovation of China，2016，13（16）：056-060

First-author's address：Hexian Memorial Hospital of Panyu District in Guangzhou City，Guangzhou 511400，China

早产（preterm birth）是围产医学中的一个重要、复杂而又常见的妊娠并发症。目前我国将妊娠满28周至不足37周间分娩定义为早产，在上述期间出生的体重1000～2499 g、身体各器官未成熟的新生儿称为早产儿，其发生率约5%～15%［1］。75%以上的围产儿死亡与早产有关，存活的早产儿常合并有严重的疾病如：呼吸窘迫综合征、颅脑发育异常、视力或听力异常等，不但大量消耗了有限的医疗资源，长远来看，还给患儿家庭及社会带来极大的负担。因此，明确早产的病因病机、针对病因防治早产及延长孕龄是降低围产儿病残率和死亡率，提高新生儿素质的主要措施［2-3］。早产根据病因可以分为治疗性和自发性两种：治疗性早产为医源性或复杂的病理产科因素需提前终止妊娠者，占25%；自发性早产（spontaneous preterm birth，SPB）包括未足月分娩发作和未足月胎膜早破，占75%，故SPB的防治是预防早产的重点。由于对早产病因学研究的重视，该领域已取得较大进展，然而，其病因病机复杂，至今仍未完全阐明。近年随着生殖免疫学研究的进步，早产免疫机制的研究越来越受到重视，大量的研究表明母胎界面免疫系统功能紊乱可能是SPB发生的关键原因。早在十多年前，国外学者在有关早产免疫发病机制的研究过程中注意到某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的SPB发生率明显增高，因此，提出部分不明原因的SPB可能与抗磷脂抗体（antiphospholipid，APA）介导的免疫损伤有关［4］。产科疾病和APA关系极为密切，胎盘是APA攻击的主要靶器官，当累及子宫胎盘可导致多种病理妊娠发生，如习惯性流产、死胎、先兆子痫、胎儿生长受限及早产［5-9］。然而由于抗磷脂综合征（APS）病因病机、临床表现复杂，实验室检测方法的限制等，该领域的研究迄今仍存在许多空白，研究结果虽然肯定了APA与病理妊娠的密切关系，但临床上总是发现外周血APA水平与临床表现不一致的情况。临床表现典型但反复血清反应阴性的APS引起研究人员和临床工作者的重视［10］。患者全身的APA水平也许不能真实反应靶组织局部的APA水平，因此，直接针对靶组织胎盘进行研究可能更直接、更具有临床意义。目前国内外关于APS与习惯性流产、先兆子痫、胎儿生长受限的研究较多，但关于APS与早产关系的研究鲜有报道。虽然动物模型的研究结果肯定了补体系统激活和APA在早产发病机制中的重要作用，但由于人体实验数据的缺乏，APA在人体内造成早产的确切机制尚未得到充分阐明。

本研究通过对自发性早产产妇及正常足月分娩产妇进行成组设计的病例对照研究，通过流行病学调查，采用酶联免疫吸附法测定外周血及胎盘组织匀浆中与临床表现密切相关的APA、LA与β2GPⅠ，免疫组化法观察胎盘组织补体C3、C5及免疫复合物IgG、IgM的沉积情况，尝试从母胎界面补体激活机制的角度探讨APA在自发性SPB免疫机制中的作用，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2015年2月-2016年2月本院收治的60例早产分娩产妇作为病例组，另择同期60例正常分娩产妇作为对照组。按照预先设计的危险因素调查表收集研究对象的危险因素，调查主要内容包括一般情况，如年龄、体重、身高、教育水平、经济水平、不良生活习惯（如吸烟酗酒）等；既往病史情况，如复发性流产、早产、先兆子痫等病理妊娠病史、孕产史等。其中，存在以下病理妊娠史之一者被认为具有病理妊娠病史：（1）既往发生至少1次不能解释的孕10周或10周以上的胎儿死亡；（2）至少1次因先兆子痫、子痫或严重胎盘功能不全导致孕34周或34周以上的早产；（3）既往发生3次或3次以上的孕10周前自发流产。所有患者均签署了临床试验研究知情同意书，两组在平均年龄、体重、身高方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1　两组产妇一般资料比较

1.2诊断、纳入及排除标准

1.2.1诊断标准 根据谢幸等［11］的诊断标准，妊娠满28周至不足37周间分娩者，判断为早产；妊娠满37周至不满42足周期间分娩者，判断为足月产。根据末次月经时间和妊娠20周以前的B超结果确定孕周。

1.2.2纳入标准 （1）根据诊断标准诊断为早产的患者；（2）各项生命体征基本平稳。

1.2.3排除标准 （1）年龄＜18岁或＞40岁；（2）平时月经不规则或末次月经不清，又缺乏B超检查资料而难以精确估计孕龄者；（3）剖宫产手术分娩者；（4）合并严重内科合并症、产科并发症和生殖道畸形者；（5）近期合并急性全身性或生殖道感染性疾病者；（6）羊水过多或多胎妊娠等导致子宫过度膨胀者；（7）宫颈机能不全者；（8）胎儿畸形者；（9）吸烟、酗酒、吸毒或长期服药者；（10）既往曾接受输血、器官移植或免疫治疗者。

1.3方法

1.3.1标本采集及处理 （1）血液标本的采集及处理：两组产妇在胎儿娩出后抽取肘静脉血5 mL，静置30 min后2000 r/min离心10 min，取上清液，过滤除菌，-20 ℃保存，待测抗ACA、LA及β2GPⅠ抗体；（2）胎盘组织的采集及处理：胎盘娩出后立即于脐带附着处避开明显梗死区、钙化区，剪取胎盘母面的几个绒毛小叶，4 ℃生理盐水冲洗干净，吸干水分，以制备胎盘匀浆。另同时剪取约20 mm×20 mm×20 mm大小的全层胎盘组织，用生理盐水反复漂洗后，将绒毛和漂洗后的胎盘组织置入4%中性多聚甲醛中固定，以备免疫组化检查；（3）胎盘组织匀浆的制备：将采集的新鲜胎盘组织用预冷的25 mmol/L、pH 7.4的PBS充分漂洗，吸干水分，称取500 mg，加入2 mL PBS，置匀浆机上制成匀浆，2000 r/min离心20 min，取上清液-20 ℃保存，待测ACA、LA及抗β2GPⅠ抗体。

1.3.2指标测定 （1）ACA、LA及抗β2GPⅠ抗体水平测定：采用酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测两组产妇外周血及胎盘组织匀浆中的ACA、LA及抗β2GPⅠ抗体水平。阳性结果判断标准为血清：ACA＞14.9 U/mL，抗β2GPⅠ抗体＞7.8 U/mL，LA比值＞2.0；胎盘组织：ACA＞476.8 U/g，抗β2GPⅠ抗体＞24.18 U/g，LA比值＞2.0［12］。（2）胎盘组织免疫组化检查：将预先放置4%中性多聚甲醛中固定的胎盘组织进行石蜡包埋，制成5 μm厚的连续切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，经HE染色，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（SP）标记ACA（1∶200）、LA（1∶50）和β2GPⅠ（1∶100），所有抗体购自于Abcam公司，使用Imge-Pro Plus 6.0分析表达强度，参照Remmele and Stegnerde的IRS（immuno-reactivescore）法评价补体C3、C5和免疫复合物IgG、IgM的沉积情况，4分以上为阳性。

1.4统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1外周血清及胎盘组织匀浆中抗ACA、LA及β2GPⅠ抗体水平检测结果 病例组胎盘组织中ACA、LA和抗β2GPⅠ抗体水平较外周血更为灵敏，两者比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。除外周血LA外，其余各项指标两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2胎盘组织C3、C5、IgG、IgM免疫组化阳性检查结果 病例组胎盘组织中C3、C5、IgG和IgM沉积极为显著，而对照组基本无沉积，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3，两组胎盘组织免疫组化染色见图1。

表2　两组产妇外周血、胎盘组织匀浆中ACA，LA和β2GPⅠ阳性检测结果比较　例（%）

表3　两组C3、C5、IgG、IgM免疫组化阳性检查结果比较　例（%）

图1　两组胎盘组织免疫组化染色图片

3　讨论

本研究对自发性早产产妇及正常足月分娩产妇各60例进行了对照研究，研究结果显示，不良生活习惯和病理妊娠史是诱发SPB的两个重要的危险因素，这与相关流行病学报道的结论一致［13］。SPB产妇外周血中LA抗体阳性检出率不灵敏，ACA和β2GPI抗体检出率有一定显著性，因此从临床研究的角度证实了SPB与外周血ACA、LA和β2GPI的相关性存在着一定的争议性［14］。进而，在SPB产妇的胎盘组织的检测中，笔者首次发现ACA、LA和β2GPI抗体阳性率显著升高，而正常产妇阳性发生率极低，这说明胎盘组织中的ACA、LA和β2GPI抗体水平更能准确反映与SPB关系。另一方面，笔者检测胎盘补体系统的结果显示，SPB产妇胎盘组织中补体沉积现象明显高于对照组，显示APS诱导SPB机制可能与APS激活产妇补体系统有密切关系，从临床的角度证实了动物实验关于补体系统激活与APS的研究结论［15-17］。

APA是一组能识别多种含有磷脂结构的抗原物质并与其结合的自身免疫性抗体，具有多种不同类型的靶抗原。根据APA识别的靶抗原不同如识别磷脂（如心磷脂）或磷脂结合蛋白（如β2糖蛋白Ⅰ），分别称之为抗心磷脂抗体（ACA）或抗β2糖蛋白Ⅰ抗体（anti-β2GPⅠ）。LA是一种磷脂依赖的病理性循环抗凝物质，在体内通过识别磷脂，结合凝血酶原，抑制抗凝血过程，促进血栓形成［18］。因此，前期该领域的研究大多以ACA和/或LA作为观察指标。而β2GPⅠ是最主要血浆磷脂结合蛋白，其结构中既有磷脂结合位点，又存在APA结合区，能高亲和力地结合磷脂后形成磷脂β2GPⅠ复合物，使β2GPⅠ构型改变，暴露出能被APA识别的表位，然后APA才与此复合物作用。ACA、LA并非直接作用于磷脂，而是可能通过和磷脂/β2GPⅠ复合物结合后产生APA，APS的主要病理改变是由磷脂/β2GPⅠ复合物及其抗体引起的［19］。在此基础上，笔者的研究进一步证明胎盘组织中的ACA、LA和β2GPⅠ抗体水平更能准确反映与SPB的关系。目前关于APA影响妊娠过程的确切机制尚不清楚，一般认为APA导致病理妊娠与其导致母胎界面上微血栓形成有关。然而，在对APS患者胎盘、绒毛组织等进行病理分析时，发现胎盘中并没有明显的血栓形成，而是有大量的免疫复合物沉积于绒毛滋养细胞胞浆和绒毛血管壁上，因而补体系统的过度活化可能是APS患者病理妊娠的中心机制［4］。有学者推测APA可能是通过过度激活胎盘的补体系统，导致大量的补体活化产物C3a和C5a产生，在胎盘局部募集炎性细胞，并释放血管活性物质，导致胎盘组织局部炎性反应、血栓形成及组织缺氧，最终导致病理妊娠的发生［6，16］。笔者的研究结果进一步从临床的角度证明了APA诱导早产的病理机制与母胎界面的补体系统的活化密切相关。动物实验研究发现，在被动转移人类APA建立的小鼠模型中，分别给予肝素类和其他抗凝血药物，结果发现低分子肝素显著降低流产及早产发生率，在只利用具有抗凝作用而无补体抑制的抗凝血药时，并不能抑制流产和早产的发生［4］。动物模型实验研究证实了补体系统激活和APA在早产发病机制中的重要作用，补体系统的过度激活是APA导致早产的机制之一。在此基础上，笔者的研究表明APA阳性孕妇的早产风险显著增加，并且APA导致早产的病理过程与母胎界面补体系统的激活密切相关，可能是APA诱导早产的核心病理机制。

本研究不但联合检测目前被认为与临床表现的关系最为密切的三种抗磷脂抗体（抗β2GPⅠ抗体、ACA和LA）水平，增加了抗体的检出率及检测的准确率；而且首次直接检测胎盘组织匀浆中三种抗体水平，并与外周血中的抗体水平比较，直接阐明检测胎盘组织中的抗体水平较检测外周血中的抗体更具有临床意义，合理解释了临床经常出现血清抗体水平与临床表现不一致的现象，为进一步开展母胎界面APA水平与其他病理妊娠关系的研究提供新的科研思路和科研方向。同时，也为更深入、全面了解SPB的免疫机制提供科学的临床研究数据，为今后针对APA介导的补体系统激活机制预防和治疗早产提供科学依据［20-21］。

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Study on the Maternal Fetal Interface of Antiphospholipid Antibodies and Complement Activation Mechanisms of Spontaneous Preterm Birth

DU Pei-ying，LIU Bao-ling，LI Zi

【Key words】Premature delivery； Antiphospholipid antibodies； Complement system

【Abstract】Objective：To investigate the relationship between the level of anti phospholipid antibodies （APA） and complement activation in peripheral blood and placental tissues and spontaneous preterm birth （SPB）. Method：From February 2015 to February 2016，60 premature delivery woman in our hospital were selected as the case group and another 60 normal delivery women as the control group，two groups of peripheral blood and placental tissue with anticardiolipin antibody （ACA），lupus like anticoagulants （LA） and anti β2GPⅠ antibody level were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），the complement system （including C3，C5，IgG and IgM） in placental tissues was detected by immunohistochemistry method.Result：The APA，LA andβ2GPⅠlevel of placental tissue in the case group were more sensitive combined with peripheral blood，the differences were statistvcally significant（P＜0.05）.C3，C5，IgG and IgM deposition of placenta tissue in case group were extremely significant，while the control group had no deposition，the differences were statistvcally significant （P＜0.05）.Conclusion：The ACA，LA and β2GPⅠ antibody indexes of placenta tissue can reflect the condition of SPB，complement system activation is closely related to the APA induced SPB process.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.016

*基金项目：2015年番禺区区级医疗卫生预立项目（2015-Z03-53）

通信作者：杜佩英

收稿日期：（2016-03-31） （本文编辑：李颖）