金丝草提取物对急性肾衰竭大鼠肾组织中载脂蛋白M的表达及NF-κB抑制剂的干预作用

李元宁

(青海省红十字医院肾内科，青海　西宁　810000)

金丝草提取物对急性肾衰竭大鼠肾组织中载脂蛋白M的表达及NF-κB抑制剂的干预作用

李元宁

(青海省红十字医院肾内科，青海西宁810000)

〔摘要〕目的金丝草提取物对急性肾衰竭(ARF)大鼠肾组织中载脂蛋白(Apo)M的表达及核转录因子(NF)-κB抑制剂的干预作用。方法雄性Wistar大鼠76只，7～10周龄，体重(200±30)g,分为模型组18只、金丝草组19只、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTF)组19只及对照组20只。以摘除右肾，结扎左肾动脉血流建立ARF模型，从造模成功后第2天开始，金丝草组按80 mg/kg 腹腔注射金丝草水提物；PDTF组腹腔注射NF-κB抑制剂PDTF 100 mg/kg，模型组和对照组均腹腔注射等体积的蒸馏水,1次/d,连续8 w。模型组和对照组均以等体积的蒸馏水灌胃,1次/d,连续8 w。观察肾组织病理改变并测定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量，Western印迹法检测ApoM、NF-κB蛋白表达水平。结果治疗后各组SCr、BUN水平、ApoM、NF-κB蛋白除模型组的外均明显下降(P<0.05)，与PDTF组相比金丝草组下降更为明显(P<0.05),且ApoM与NF-κB的表达符合直线正相关(r=0.838，P<0.01)。病理切片显示金丝草组可见极少炎性细胞，肾脏病变比PDTF组明显减轻。结论金丝草提取物及NF-κB抑制剂能够明显降低ARF大鼠肾组织中ApoM的表达水平。

〔关键词〕金丝草提取物；急性肾衰竭；载脂蛋白M；核转录因子-κB抑制剂

急性肾衰竭(ARF)发病率呈上升趋势〔1〕，且死亡率高，目前主要靠早期血液透析治疗,但给患者造成痛苦且仪器设备昂贵〔2〕。有研究显示金丝草对ARF确有相应的辅助治疗作用〔3〕，能够有效降低ARF大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量，延缓肾脏衰竭病程进展〔4〕，但相关报道尚少。本文通过观察ARF大鼠肾组织中载脂蛋白(Apo)M的表达及核转录因子(NF)-κB抑制剂的干预作用来探究金丝草提取物对ARF的治疗作用。

1资料与方法

1.1实验动物雄性Wistar大鼠80只，7～10周龄，体重(200±30)g，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.2仪器及试剂金丝草水提物、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTF)(Sigma公司)，BUN、SCr血清生化检测试剂盒(生化试剂公司)，自动生化分析仪(日立750日本)，ApoM兔抗人多克隆抗体(瑞典隆德大学临床化学研究所)，NF-κB兔抗大鼠多克隆抗体(Santa Cruz)。

1.3实验方法

1.3.1模型的建立随机选取60只大鼠，用1%戊巴比妥钠(3 ml/kg 体重)腹腔注射麻醉，剪毛，消毒后腹部正中切口， 分离双侧肾脏，摘除右肾，暴露左侧肾脏,结扎左上支和中支肾动脉血流45 min，灌注24 h复制ARF模型大鼠。对照组只切除右肾，对左肾不做处理，缝合切口。腹腔注射青霉素,连续3 d，预防感染。

1.3.2分组和用药60只造模大鼠因麻醉死亡1只，由于ARF死亡3只，余下56只大鼠随机分为模型组18只、金丝草组19只及PDTF组19只。从造模成功后第2天开始，金丝草组按8 mg/kg腹腔注射金丝草水提物；PDTF组腹腔注射NF-κB PDTF，模型组和对照组均腹腔注射等体积的蒸馏水,1次/d,连续8 w。

1.4检测指标及观察方法

1.4.1SCr、BUN含量测定各组大鼠开腹，下腔静脉取血3 ml，使用自动生化分析仪检测各组大鼠的SCr、BUN水平。

1.4.2Western印迹法检测ApoM、NF-κB蛋白表达切除左肾,迅速分离60 mg肾皮质,冰上匀浆,抽提胞质蛋白和核蛋白,BCA法定量，分离胶浓度12%,浓缩胶浓度6%，电泳后将蛋白电转移至PVDF膜，Ⅰ抗(ApoM兔抗人多克隆抗体，浓度1∶10 000、NF-κB兔抗大鼠多克隆抗体，浓度1∶800),Ⅱ抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔，浓度1∶2 000),孵育1.5 h后洗膜，按照化学增强发光试剂盒说明进行化学发光,最后用凝胶成像系统自动曝光、扫描。

1.4.3肾组织病理学检查取各组大鼠肾组织，10%中性甲醛固定24 h,脱水、透明、浸蜡、常规石蜡包埋，制备石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肾脏病理改变。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验。

2结果

2.1模型验证造模后第3天开始造模大鼠出现进食量逐渐减少，精神萎靡不振，眯眼，竖毛拱背，眼睑浮肿，畏寒怕冷，活动量减少，毛色干枯；第6天开始尿量减少，体重明显减轻，出现个别死亡如生命质量下降。尾部取血3 ml，离心后检测其SCr〔(90.93±12.45)μmol/L〕、BUN〔(38.82±9.81)mmol/L〕含量与对照组〔(62.73±11.32)μmol/L、(7.43±2.38)mmol/L〕相比有明显差异(P<0.05)，证明造模成功。

2.2各组大鼠SCr、BUN水平比较与对照组相比,ARF模型组大鼠的SCr、BUN水平明显升高,治疗后治疗各组SCr、BUN水平均下降，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，与PDTF组相比，金丝草组SCr、BUN水平下降更为明显(P<0.05),见表1。

表1　治疗前后各组大鼠SCr、BUN水平比较

与模型组相比：1)P<0.05，与PDTF组相比：2)P<0.05；下表同

2.3各组大鼠ApoM、NF-κB蛋白表达水平及相关性分析与对照组相比,ARF模型组大鼠的ApoM、NF-κB蛋白表达明显升高，治疗后治疗各组ApoM、NF-κB蛋白水平均下降，与模型组相比，差异显著(P<0.05)，与PDTF组相比，金丝草组ApoM、NF-κB蛋白表达下降更为明显(P<0.05),见表2。且ApoM与NF-κB的表达符合直线正相关(r=0.838，P<0.01)。

表2　各组大鼠ApoM、NF-κB蛋白表达水平比较

2.4肾组织病理学改变肾组织学检查可见,对照组肾脏组织结构正常，模型组镜下见肾小管上皮细胞空泡变性、坏死,管腔内各种管型,肾间质有炎性细胞浸润，PDTF组有少量炎性细胞;金丝草组可见极少炎性细胞，肾脏病变比PDTF组明显减轻。见图1。

图2　各组大鼠肾组织病理图片

3讨论

ARF是以急性肾小管坏死为特征的临床重危病症,死亡率极高。中医学中虽无“急性肾功能衰竭”一词,但《黄帝内经》就有“关格”、“瘾闭”、等近似病证〔5〕。从大量的古代文献中,可找到类似肾功能衰竭的描述。《素问·宣明五气篇》就有“膀肤不利为瘾”的记载〔6〕。《素问·奇病论》中的“有病庞然如有水状,切其脉大紧,身无痛者,形不瘦……,病生在肾,名为肾风,肾风而不能食,善惊,惊己,心气萎者死。”类似于肾衰的消化、心血管和神经系统症状〔7〕。现代研究显示，ApoM是最近发现的一种新型Apo,在1999年首次被鉴定和分离，在血浆中主要存在于高密度脂蛋白(HDL),也存在于低密度脂蛋白(LDL)和脂肪餐后的富含甘油三酯脂蛋白(TRL)〔8〕,其生理功能尚未完全阐明。ApoM仅在肝脏和肾脏,肾脏近曲小管ApoM的高表达,提示ApoM在分泌和重吸收尿液过程中的物质代谢方面具有一定的生理学作用，因此其表达水平的高低可以反映肾衰程度〔9〕。核转录因子(NF)-κB是真核细胞中普遍存在的一种转录因子。一般以非活化的状态存在,当细胞受到刺激因子刺激时,NF-κB被激活,转位至细胞核,与细胞因子、细胞黏附分子等反应基因位点结合〔10〕,因此在调节免疫应答、细胞增殖、凋亡等方面起到了关键作用〔11〕。因此,NF-κB已成为肿瘤、炎症等疾病新的治疗策略。

本研究表明金丝草提取物和NF-κB抑制剂均能改善SCr、BUN水平，且PDTC能够通过降低肾脏的NF-κB水平改善肾组织的SCr，BUN水平，缓解ARF症状，达到治疗ARF的目的。

4参考文献

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11Alessandrini A,Namura S,Moskowitz MA,etal.MEK1 protein kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1999;96(10):12866-9.

〔2015-08-11修回〕

(编辑李相军)

〔中图分类号〕R692.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2619-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.023

第一作者：李元宁(1976-)，男，主治医师，主要从事肾病内科研究。