2010—2013年上海长宁地区成人轮状病毒急性胃肠炎的分子特征

徐仲卿，沈思兰，朱绍琴，张万菊，胡芸文，钱方兴

1. 上海市同仁医院，上海交通大学医学院附属同仁医院，上海 200336； 2. 上海市公共卫生临床中心，上海 201508

*同为第一作者

2010
—2013年上海长宁地区成人轮状病毒急性胃肠炎的分子特征

徐仲卿1,*，沈思兰1,*，朱绍琴2，张万菊2，胡芸文2，钱方兴1

1. 上海市同仁医院，上海交通大学医学院附属同仁医院，上海 200336； 2. 上海市公共卫生临床中心，上海 201508

摘要：为研究上海长宁地区成人轮状病毒急性胃肠炎的分子特征，收集2010年6月—2013年12月长宁区定点医院成人急性胃肠炎患者的粪便标本1 554份，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行A组轮状病毒检测，多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行B组和C组轮状病毒检测。结果显示，1 554例患者的平均年龄为(46.19±15.59)岁，其中男性691例、女性863例。共检出轮状病毒200株，检出率为12.87%。18～39岁组的轮状病毒检出率为9.15%，40～59岁组为15.58%，60～79岁组为15.16%，≥80岁组为18.57%。A组轮状病毒基因型检测结果显示，G型以G9亚型最多(29.82%)，P型以P[8]亚型最多(77.19%)，GP组合以G9P[8]最多(25.73%)。结果提示，2010—2013年上海长宁地区成人轮状病毒急性胃肠炎在就诊患者中以中老年多见，基因型以G9P[8]最多。

关键词：腹泻；基因型；轮状病毒；急性胃肠炎

全球范围内每年约有25亿儿童发生腹泻，其中1.14亿与轮状病毒(rotavirus，RV)相关，可造成2 400万人次就诊，240万人次住院，52.7万人死亡[1]。我国每年有近3万名5岁以下儿童死于轮状病毒腹泻[2]，因腹泻入院的5岁以下儿童轮状病毒检测阳性率高达47.8%[3]。虽然轮状病毒引起的急性胃肠炎在成人中较少见，但其相关性胃肠炎在成人和老年人中的暴发时有报道[4-6]，给国民健康造成了一定影响。轮状病毒由澳大利亚的Bishop于1973年在儿童急性腹泻患者的十二指肠组织中首次发现。轮状病毒是双链RNA病毒，隶属于呼肠病毒科轮状病毒属，基因组由11个不连续片段组成[7]。根据抗原性和遗传特性分为8个组(A～H)，其中A、B、C三组轮状病毒被证实可感染人类[8]。大部分人类感染由A组病毒引起；B组病毒由我国洪涛首次发现[9]，可导致成人胃肠炎流行；C组病毒则多呈散发。为进一步了解轮状病毒在成人中的流行情况，本研究对2010—2013年上海市长宁区定点医院的成人急性胃肠炎患者粪便标本进行轮状病毒基本流行病学调查，检测型别，着重分析其分子特征。

1材料与方法

1.1标本来源

选择上海交通大学医学院附属同仁医院作为监测哨点，收集2010年6月—2013年12月1 627例成人急性胃肠炎患者的基本临床资料及粪便标本，剔除资料不全及不合格标本，共检测粪便标本1 554份。所有病例均符合以下标准：①年龄≥18岁；②24 h内经历呕吐与腹泻(稀便或水样便≥3次)，以急性胃肠炎为主诉就诊；③粪便中不含黏液或血液。每例患者只采集1份标本，标本采集覆盖全年各月。采用配额抽样方法，每周平均采集5～20份，所有标本储存于-80 ℃冰箱，每半年统一检测。排除标准：症状持续2周以上、终末期疾病、重度精神障碍，以及公认的、非感染性的腹泻或呕吐(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、囊性纤维化、乳糜泻、酒精过量、妊娠呕吐等)。

1.2标本处理

采集粪便标本后，立即用标本处理液﹝磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)或生理盐水﹞制备成10%的混悬液，震荡3次，每次10 s，然后静置10 min，8 000 r/min离心5 min，吸取上清液进行实验或置-80 ℃冰箱保存备用。

1.3核酸提取

取200～400 μL处理好的粪便标本上清液，提取核酸后适当分装，在-80 ℃冰箱内至少保存1份备份核酸，便于后续研究和抽样检测。核酸提取方法使用QIAamp®Viral RNA Mini Kit或Geneaid Biotech病毒核酸提取试剂盒，操作方法详见说明书。

1.4轮状病毒检测

A组轮状病毒采用ProSpecTTMRotavirus Kit(Oxoid公司)试剂盒，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行抗原检测，所有轮状病毒阳性标本用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行G、P分型。B组和C组轮状病毒及其他病毒(包括诺如病毒、札幌病毒、星状病毒、腺病毒)采用多重PCR进行核酸检测。B组和C组轮状病毒的引物序列见表1。

表1B组和C组轮状病毒引物序列

Tab.1Primers of group B and C rotaviruses

RotavirusPrimerPolaritySequence(5'-3')Productsize(bp)GroupBB5-2+GGCAATAAAATGGCTTCATTGC814B5-3-GGGTTTTTACAGCTTCGGCTGroupCNG8S1+ATTATGCTCAGACTATCGCCAC352NG8S2-GTTTCTGTACTAGCTGGTGAAC

1.5统计学处理

2结果

2.1病原学检测

2.1.1病原学检测结果2010年6月—2013年12月共收集1 554例成人急性胃肠炎患者粪便标本。患者年龄18～93岁，平均(46.19±15.59)岁；男691例、女863例。共检出轮状病毒阳性标本200份，检出率为12.87%(其中单独轮状病毒感染189例，轮状病毒混合其他病毒感染11例)。A组轮状病毒阳性171份，检出率为11.00%；B/C组轮状病毒阳性29份，检出率为1.87%。

在单独轮状病毒感染中，A组轮状病毒检出163份，检出构成比为95.32%(163/171)；B/C组轮状病毒检出26份，检出构成比为89.66%(26/29)。在轮状病毒混合感染中，A组轮状病毒检出8份，占72.73%(8/11)；B/C组轮状病毒检出3份，占27.27%(3/11)(图1)。

图1轮状病毒检出率

Fig.1Detection rate of rotavirus

2.1.2轮状病毒阳性组与阴性组患者一般情况比较轮状病毒阳性组患者平均年龄(49.83±14.37)岁，大于阴性组的(45.58±15.74)岁(P<0.01)。性别构成方面，两组无显著差异(表2)。

表2轮状病毒阳性组与阴性组患者的一般情况及临床症状比较

Tab.2Comparison of rotavirus-positive and negative groups

ParameterRotavirus-positiveRotavirus-negativePvalueTotal(n)2001354Age(year)49.83±14.3745.58±15.740.002Male/female90/110601/7530.871Watery diarrhea(n)19012080.011Vomitting(n)572860.019Fever(n)191130.756

2.1.3不同年龄组的轮状病毒检测结果将患者按年龄分为4组：18～39岁组、40～59岁组、60～79岁组、≥80岁组。18～39岁组的轮状病毒检出率为9.15%，40～59岁组为15.58%，60～79岁组为15.16%，≥80岁组为18.57%。统计学分析显示，18～39岁组的轮状病毒检出率低于其他3组，有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；其他3组之间差异无统计学意义(表3)。

表3不同年龄组的轮状病毒检测结果

Tab.3Detection rate of rotavirus in groups with different ages

Age(year)Rotavirus-positiveRotavirus-negativeDetectionrate(%)Total200135412.8718-39616069.1540-597942815.58*60-794726315.16*≥80135718.57**

*P<0.05,**P<0.01 compared with 18-39 years group.

2.1.4不同季度的轮状病毒检出率在连续3年半的监测中，轮状病毒检出率高于平均检出率(12.87%)的季度是2010年第4季度(32.54%)、2011年第1季度(18.88%)、2011年第4季度(16.67%)、2012年第1季度(13.11%)、2013年第1季度(12.90%)、2013年第4季度(28.97%)(图2)。

图2不同季度的轮状病毒检出率

Fig.2Detection rate of rotavirus in different seasons

2.2临床症状

统计腹泻、呕吐、发热3种主要临床症状。轮状病毒阳性患者中，95.00%(190/200)有水样泻，28.50%(57/200)有呕吐症状，9.50%(19/200)出现发热。轮状病毒阴性患者中，89.22%(1 208/1 354)有水样泻，21.12%(286/1 354)有呕吐症状，8.35%(113/1 354)出现发热。轮状病毒阳性组的水样泻和呕吐发生率较阴性组高(P<0.05)；两组发热的发生率无显著差异(P>0.05)(表2)。

2.3基因分型

2.3.1基因分型结果G基因型：共检出A组轮状病毒171例，其中51例为G9亚型，占29.82%；43例为G1亚型，占25.15%；27例为G3亚型，占15.79%；26例为G2亚型，占15.20%；15例为混合型，占8.77%；9例未明确基因型，占5.26%。P基因型：共检出A组轮状病毒171例，其中132例为P[8]亚型，占77.19%；29例为P[4]亚型，占16.96%；5例为混合型，占2.92%；5例未明确基因型，占2.92%。GP组合：在GP组合中，最多见的依次是G9P[8](44，25.73%)、G1P[8](39，22.81%)、G3P[8](26，15.20%)、G2P[4](24，14.04%)。G9P[4]、G1P[4]、G2P[8]、G3P[4]较为少见，分别占3.51%、1.75%、1.17%、0.58%。

2.3.2基因遗传树分析分子进化树分析用MEGA 5.0构建，其中构树算法采取邻接法(neighbor-joining，NJ)，Bootstrap值标注在每个基因型别分支的交叉点(重复1 000次)。底部数值代表各序列间的进化距离。代表G9株的SPH0127、SPH0144、 SPH1971和SPH2662(GenBank 登记号为 KC200153～KC200156)根据进化系统分为两组，一组包括SPH0127和SPH2662，另一组包括SPH0144和SPH1971(图3)。

图3基因进化树

Fig.3Phylogenetic tree

3讨论

急性胃肠炎是一种常见肠道传染病，是世界卫生组织(World Health Organization，WHO)关注的一个非常重要的公共卫生问题[10]。病毒是引起急性胃肠炎的最常见病原体，轮状病毒胃肠炎是欠发达国家和发展中国家婴幼儿死亡的主要原因之一[11]。轮状病毒感染在成人中虽较少见，但仍可能对国民健康造成损害[12-13]。

本研究选取2010—2013年上海长宁地区以急性胃肠炎为主要症状的成人患者，全面系统地调查了1 554例患者中轮状病毒感染的流行病学及分子特征。结果显示，轮状病毒(包括单独及混合感染)检出率为12.87%，其中A组轮状病毒检出率为11.00%，B/C组轮状病毒检出率为1.87%，高于王远虹等[14]、陈锦生等[15]的报道(8.1%、7.7%)，但远低于泰国的检出率(27%)[16]，与日本的监测水平(14%)相当[17]。各地区检测率变化较大的原因有待进一步研究。

不同年龄组患者的轮状病毒检测结果显示，18～39岁组检出率低，≥40岁以上组检出率相对较高，可能与青壮年人群机体免疫力较强有关；在≥40岁的中老年人群中，≥80岁的高龄老人轮状病毒检出率最高，但无统计学差异，推测与高龄患者样本量较少有关，今后需扩大样本继续研究。不同性别人群中，轮状病毒检出率无差异。在连续三年半的监测中，高于平均检出率的季度均是每年第1和第4季度，提示上海长宁地区成人轮状病毒性胃肠炎以冬春季多见。

既往研究显示，在可感染人类的轮状病毒基因型中，G1、G2、G3、G4及G9型最常见[18]。世界范围内常见的GP组合有G1P[4]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8][19]，本研究中最多见的GP组合是G9P[8]。

本研究发现，轮状病毒G9亚型在成人中占明显优势。在所有轮状病毒阳性病例中，超过1/4为G9亚型。G9亚型由美国于19世纪80年代早期首次发现，期间消失了10余年，直到19世纪90年代中期才又出现。在中国G9株于1994年出现[20]，其后偶发。本研究中，根据进化系统发生关系G9株可分为两组，一组包括SPH0127和SPH2662，属于子代3系，与北京[21]和武汉[22]的病毒株同源性较大；另一组包括SPH0144和SPH1971，源于日本株99-TK2091VP7。此外，这4株轮状病毒的核苷酸序列与各自参考株的同源性达95.1%～99.1%。本研究结果提示，上海长宁地区有2种不同子系的G9株，这可能是病毒传播过程中存在VP7区基因变异。

尽管中国大部分地区10余年来存在低频率G9亚型感染的发生，但G9株在监测哨点医院作为轮状病毒优势亚型之一的原因目前仍不清楚[23-26]。由于轮状病毒的自然感染不会产生终身免疫，是否感染及感染严重与否依赖宿主自身的免疫状态。在某些环境中，无症状的成人感染者可作为潜在感染源导致疾病流行或暴发，且成人感染会引起一定程度的基因变异，尤其是病毒在传播过程中存在VP7区基因变异，从而降低了基于VP7区基因研制的多价轮状病毒疫苗的免疫效果，限制了此种疫苗在儿童中的使用。因此，在疫苗研究中需考虑到G9亚型在不同地区的流行状态，包括儿童及成人。

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Detection of rotavirus in adult acute gastroenteritis in Changning District of Shanghai, 2010-2013

XU Zhongqing1,*, SHEN Silan1,*, ZHU Shaoqin2, ZHANG Wanju2, HU Yunwen2, QIAN Fangxing1

1. Shanghai Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200336, China; 2. Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China

Abstract:In order to study the molecular characteristics of rotavirus infection in adults with acute gastroenteritis in Shanghai, 2010-2013, the stool specimens collected in the period of June 2010 to December 2013 from 1 554 adult patients with acute gastroenteritis in Changning District were subjected to enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) for rotavirus detection. The results showed that the average age of all patients was (46.19±15.59) years old. Among them, 691 were male and 863 were female. Rotavirus was detected in 200 cases, with a detection rate of 12.87%. The detection rate of rotavirus was 9.15% in the patients aged 18-39, 15.58% in those aged 40-59, 15.16% in those aged 60-79, and 18.57% in those aged ≥80. The G9 subtype (29.82%) and P8 subtype (77.19%) were the most common genotypes in group A rotavirus, and G9P[8] was the most common GP combination. The results suggest that rotavirus infection in adults with acute gastroenteritis is more popular in middle aged and elderly people.

Key words:Diarrhea; Genotype; Rotavirus; Acute gastroenteritis

基金项目：“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10004-211)

通信作者：钱方兴

Corresponding author. QIAN Fangxing, E-mail: qianfangxing@aliyun.com

(收稿日期：2016-01-04)

·论著·