Zika病毒感染的实验室诊断

宋志刚，王蔚，胡芸文

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心病原体检测与生物安全部，上海 201508； 2. 复旦大学基础医学院病原生物学系，教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

*同为第一作者

Zika病毒感染的实验室诊断

宋志刚1,*，王蔚1,*，胡芸文1,2

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心病原体检测与生物安全部，上海 201508； 2. 复旦大学基础医学院病原生物学系，教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

摘要：Zika病毒是一种新现虫媒黄病毒，近期在美洲暴发流行，并有向全球扩散的趋势，已成为国际关注的突发公共卫生事件。Zika病毒感染的临床诊断主要依据实验室检测结果。本文就Zika病毒的核酸检测、抗原和抗体检测、病毒分离鉴定等方面进行综述。

关键词：Zika病毒；实验室检测；反转录-聚合酶链反应

Zika病毒(Zika virus，ZIKV)是伊蚊传播的虫媒病毒，于1947年首次分离自乌干达Zika森林中的恒河猴。2005年以前在非洲和东南亚区域有散发的Zika病毒人感染病例[1]。2007年在西太平洋密克罗尼西亚联邦雅浦岛(Yap Island)，首次暴发人感染Zika病毒疫情[1]。2007年1月―2016年3月，在全球52个国家和地区出现Zika病毒感染病例，尤其是2015年以来在太平洋地区和美洲地区大规模流行[2-5]。人感染Zika病毒多数能自愈，感染引起的临床症状轻微，多为流感样表现，部分患者出现格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)[1-2]。然而，2015年巴西疫情中，孕妇感染Zika病毒被认为与新生儿发生小头畸形有密切关系[5]。

随着Zika病毒在世界范围内的传播扩散及疫情加重，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和各国均发布了Zika病毒病预防控制方案，我国也及时发布了2016年Zika病毒病诊疗方案，指导临床病例的诊断和治疗。本文对目前国际上已建立的Zika病毒病实验室诊断和鉴别诊断方法等进行简要综述。

1实验室诊断及鉴别诊断概述

Zika病毒感染的实验室诊断方法包括病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法主要是通过反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测病毒核酸；血清学诊断方法包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测病毒特异性IgM抗体及通过90%空斑减少中和试验(90% plaque-reduction neutralization test，PRNT90)检测病毒特异性中和抗体；病毒的分离和培养也是Zika病毒病的经典诊断方法之一。但在选择合适的检测方法时，需依据标本采集距离发病的时间、标本种类、临床特征、疫苗接种史和流行病学信息等综合考虑决定。送检的标本种类主要是血清和脑脊液，其他类型标本包括尿液、唾液、羊膜穿刺液、胎儿/胎盘组织等的送检可帮助提高诊断率。

1.1疑似病例(疫区旅行者)的实验室检测[6]

对于2周内到过Zika病毒流行地区且出现发热、皮疹、肌肉痛和关节痛的患者，一般采集血清，病原学检测重点在于急性期标本的病毒核酸分子检测。病毒血症消失较快，一般在发病7 d内可通过RT-PCR检测到患者血液标本中的病毒核酸。

患者血清中的病毒特异性IgM抗体可在发病3 d后被检测到，但由于发病7 d内血清中IgM抗体效价较低，检出率往往不高。另一个问题是，Zika病毒与黄病毒家族的其他成员(如登革病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等)存在较强的血清学交叉反应，因此需通过检测恢复期血清抗体来确认新近感染。病毒特异性IgM一般可持续几个月，用于ELISA检测的恢复期血清一般在发病8 d以上才被采集。但即使IgM检测结果为阳性，也不能完全确定Zika病毒感染，需进一步检测中和抗体来鉴别诊断。

通过PRNT检测中和抗体可在初次感染黄病毒时用于鉴别病原。间隔2～3周采集的急性期和恢复期双份血清如呈现4倍以上中和抗体效价升高，可确认为新近感染。

值得注意的是，上述抗体检测只适用于初次感染患者。如果既往接种过黄热病或乙型脑炎疫苗，或感染过黄病毒科其他病毒(西尼罗病毒或圣路易斯脑炎病毒)的患者，无论检测IgM抗体还是检测中和抗体均存在既往抗体干扰实验结果的问题。

考虑到Zika病毒流行地区往往也是黄病毒家族其他病毒的流行区域，对于出现相应临床症状并有疫区旅行史的可疑病例，应对黄病毒科中可导致相似临床症状的多个病原进行实验室鉴别诊断。患者血清标本如在发病7 d内采集，美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)建议，首先采用RT-PCR同时进行登革病毒、Zika病毒和基孔肯雅病毒的核酸检测，如其中一个病原检测结果为阳性，可确认特定病原感染；如3种病原均为阴性，应进行登革病毒、Zika病毒和基孔肯雅病毒IgM抗体检测，如其中任何一个病原的IgM抗体为阳性，则进一步通过PRNT检测病毒特异性中和抗体，从而确认特定病毒的新近感染(图1)。

图1美国CDC关于基孔肯雅病毒、登革病毒和Zika病毒感染的实验室鉴别诊断流程 (http://www.cdc.gov/zika/pdfs/denvchikvzikv-testing-algorithm.pdf)

Fig.1Procedure of laboratory diagnosis of infection of chikungunya virus, dengue virus and Zika virus by CDC

1.2孕妇的实验室检测[7]

出现相应临床症状并在过去2周内到过Zika病毒流行地区的孕妇，应进行Zika病毒相关检测，包括病毒核酸检测和血清学检测；而对于无临床表现但去过Zika病毒流行地区的孕妇，建议进行血清学检测。值得注意的是，长期居住在Zika病毒流行地区的孕妇，由于接触黄病毒科其他病毒的概率较高，在进行Zika病毒检测时往往IgM抗体假阳性的概率相对较高。对于长期居住在Zika病毒流行地区但无临床症状的孕妇，一般建议在产前保健时进行病毒IgM抗体检测。即使检测结果为阴性，考虑到孕妇在整个孕期过程中始终有Zika病毒感染的风险，也建议孕期中重复检测IgM抗体。如果产前超声检查发现胎儿小头畸形或颅内钙化迹象，可通过检测羊水中的病毒核酸来帮助判断宫内感染的发生。但目前尚不清楚在羊水中检测到Zika病毒核酸时胎儿发生小头畸形或其他异常的风险到底有多大。

1.3新生儿的实验室检测[8]

新生儿出生2 d内采集血液(或脐带血)、脑脊液和胎盘组织标本，用RT-PCR检测病毒核酸，血液和脑脊液还用于检测Zika病毒和登革病毒的IgM抗体，并进一步通过PRNT来确认病原。脐带和胎盘组织可采用免疫组化方法检测组织细胞中的Zika病毒抗原。在上述任一类型标本(包括羊水、胎盘或脐带组织)中，如检测到病毒核酸或抗原均可确认为病毒感染。血清Zika病毒特异性IgM抗体或中和抗体的效价高于登革病毒相应抗体4倍，也可确认为Zika病毒感染；但如果中和抗体效价差异未超过4倍，则被认为是“不确定”结果。

一旦婴儿出生时发现有小头畸形或颅内钙化症状，且其母亲在怀孕期间有感染Zika病毒的可能性，婴儿必须进行Zika病毒相关实验室检测。出生时未有小头畸形或颅内钙化表现，但其母亲在怀孕期间有感染Zika病毒的可能性，则需先对母亲进行病毒检测。如母亲Zika病毒检测结果为阴性，婴儿只需常规看护；如为阳性或“不确定”，则婴儿需进行病毒检测。一旦婴儿病毒检测结果为阳性或为“不确定”，则需接受进一步的临床评估。

1.4胎儿或婴儿尸检组织的取材和实验室检测[9]

对于胎儿组织或婴儿尸检组织的实验室检测，应同时送检甲醛固定组织和冷冻组织。如无法同时获得，则优先送检甲醛固定组织。采集的组织类型可根据孕期周数进行调整，其中脑组织的检测对确认胎儿感染至关重要，而采集过程中要保持组织结构不被破坏。胎盘组织取材应包括胎盘各组成部分。如果胎儿的组织器官能被辨认，应采集心、肺、肝、肾、骨骼肌、骨髓等组织，每种器官组织的取材大小应为0.5～1.0 cm。如胎儿器官组织尚不能被辨认，则送检可采集到的任何组织。甲醛固定或石蜡包埋的组织块可用于病理学检查，还可通过免疫组化或RT-PCR检测组织中的病毒抗原或核酸。冷冻组织主要用于检测组织内的病毒核酸。

1.5标本采集及运输的要求[10]

采集患者全血(不抗凝)分离血清，每份送检血清不少于0.5 mL，而脑脊液送检量不少于1 mL。样品在运输至实验室的过程中，需放置于带螺旋盖的密闭容器(离心管或冻存管)中，防止泄漏。用于血清学检测的样品在运输过程中需保持低温或冷冻状态。用于病毒分离和培养或病毒核酸检测的标本除血清和脑脊液外，还包括新鲜的冷冻组织。送检的冷冻组织块一般体积需1 cm3，取样后尽快于-70 ℃冻存，运输过程中需用干冰使组织块始终保持冷冻状态，而甲醛固定或石蜡包埋的组织块可在常温下运输。

1.6实验室检测的生物安全要求

Zika病毒与登革病毒相似，在我国属于危害等级第三类病原，即可在生物安全二级实验室里完成病原学、血清学检测及病毒的分离和培养[11]。特别需注意的是，与Zika病毒病有相似临床症状的基孔肯雅热往往有较高病毒载量的病毒血症期，因此在做病原鉴别诊断时需注意实验操作防护。

2Zika病毒的核酸分子检测

Zika病毒属于黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组长度为10 794 bp，由5′端非编码区(non-coding region，NCR)、单个开放读码框架(open reading frame，ORF)和3′端非编码区组成。编译的病毒多肽经蛋白酶水解后形成3个病毒结构蛋白﹝衣壳(capsid，C)、前膜(pre-membrane，preM)和包膜(envelope，E)﹞和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。E蛋白是病毒颗粒最主要的表面抗原蛋白，在病毒结合宿主细胞受体和膜融合过程中起重要作用。NS5蛋白是最大的病毒蛋白，其N端为甲基转移酶，C端为病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)，是病毒基因组复制的重要功能蛋白[12]。目前公共数据库中Zika病毒全基因组序列较少。根据NS5基因序列Zika病毒分为3个谱系(lineage)：东非(East-African)系、西非(West-African)系和亚洲(Asian)系。各系之间NS5基因核酸序列同源性达到89%，氨基酸序列相似性为97%[13]，而2015年美洲流行毒株更接近亚洲谱系序列[5,14]。

近几年来，多个研究小组已建立Zika病毒特异性核酸快速检测方法，这些方法的目标片段为病毒E基因或NS5基因，采用一步法RT-PCR或实时荧光RT-PCR[1,15-19]。针对E基因，Lanciotti等[1]设计两组特异性引物和探针，建立了Zika病毒双重实时RT-PCR。两组引物和探针的最低检出限分别达到25和100病毒RNA拷贝/反应。对于临床血清标本，两组检测若同时阳性，则判为阳性；若同时阴性，则判为阴性；若只有一组阳性或两组的循环阈值(cycle threshold，Ct)均>38.5，则为“可疑样本”，需结合临床和血清学检测进一步确诊。该方法在2007年雅浦岛[1]和2013年法属波利尼西亚群岛疫情[2]中被应用，并可用于检测尿液和唾液样本[1,20]。Faye等[15]采用传统RT-PCR结合凝胶电泳，设计E基因特异性引物，扩增产物长度364 bp，最低检出限为7.7 pfu/反应。该方法成功检测出37例非洲分离毒株，各非洲毒株间序列相似性达92%～99%，但该方法未经过非洲谱系以外的毒株验证。

随着Zika病毒的传播，研究发现并非所有E基因检测法适用于非洲和亚洲毒株的检测[16]。各研究小组针对序列更保守的NS5基因，建立了新的检测方法。例如，Balm等[17]采用传统RT-PCR结合凝胶电泳，扩增NS5基因片段(192 bp)，最低检出限达140病毒RNA拷贝/反应。研究者收集了新加坡2008—2011年88例发热、乏力伴关节痛或斑丘疹患者的急性期血浆标本，采用该方法筛查后未发现Zika病毒阳性标本，因此还需进一步的临床阳性标本验证。Faye等[16]建立了扩增NS5基因片段的实时RT-PCR，最低检出限为0.05 pfu/反应。但该方法目前仅用于蚊虫标本筛查检测，还需临床标本进一步验证。另外，也有扩增其他基因区域的检测方法。例如，Tapper等[18]建立了针对NS3基因的特异性实时RT-PCR，而McCrae等[19]建立了针对NS1基因和E基因的特异性双重实时RT-PCR。这些方法均成功检测出散发病例血清样本中的Zika病毒亚洲谱系。为快速鉴别诊断，有研究组还采用黄病毒NS5基因通用RT-PCR结合扩增产物直接测序的方法确认病原[21-24]。随着Zika病毒在全球更多地区的传播流行，E基因可能出现更多适应性突变，导致原引物探针特异性下降，出现检测假阴性。因此，可选取包括E基因和NS5基因在内的两种及两种以上不同靶基因的检测方法，覆盖Zika病毒各谱系，从而提高检测准确率。目前上市的商业试剂盒包括RealStar®Zika Virus RT-PCR Kit 1.0(Altona，Germany)、Genesig®Advanced Kit(Genesig，UK)、MyBioSource Zika PCR Kit(USA)、Genekam Zika Virus PCR(USA)和ZIKV PCR Kit by Fast-Track(Luxembourg)等，但均为科研用途试剂，而非通过认证的临床诊断试剂。

3Zika病毒的血清学检测

自从Zika病毒发现至今，研究者建立了检测Zika病毒IgM、IgG特异性抗体和中和抗体的血清学检测方法，在多次Zika病毒病疫情和病例诊断中应用。已建立的血清学检测方法包括酶联免疫捕获法(IgM antibody capture ELISA，MAC-ELISA)检测IgM抗体、酶联免疫单克隆抗体捕获法(monoclonal antibody-based capture ELISA)检测IgG抗体、PRNT90、补体结合实验(complement fixation test，CFT)、血凝抑制(haemagglutination inhibition，HI)实验、免疫荧光(immunofluorescence assay，IFA)等。

Johnson等[25]利用单克隆抗体捕获法检测患者血中虫媒病毒的特异性IgG抗体。他们先将病毒的单克隆抗体包被在酶标96孔板上，该抗体结合病毒抗原，然后加入待检血清，血清中的抗体被酶标板上的病毒抗原捕获，再加入标记了辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗人IgG二抗，显色后即可读取光密度(optical density，OD)。以阳性OD值与阴性对照OD值的比值(P/N)为结果， P/N<2为阴性，P/N>3为阳性。Lanciotti等[1]利用该方法建立了Zika病毒特异性IgG抗体ELISA，其检测结果与标准的PRNT相符合。与传统的IgG检测方法相比，酶联免疫单克隆抗体捕获方法灵敏、特异、操作简单、生物安全性高, 具有优越性。

MAC-ELISA同样适用于Zika病毒特异性IgM抗体的检测，具有速度快、特异性强的特点。Martin等[26]首先建立了节肢动物病毒MAC-ELISA，先将抗人IgM抗体连接于固相载体，形成固相抗人IgM，待检血清中的IgM抗体能被固相抗体捕获，然后洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分，再加入的特异性抗原试剂只与固相上的特异性IgM结合，最后在加入酶标记的Zika病毒单克隆抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合。OD值的强弱反映了血清标本中特异性IgM抗体效价。Lanciotti等和Duffy等[1,27]用该方法对2007年7月密克罗尼西亚联邦雅浦州的Zika疫情进行血清学调查，发现Zika病毒IgM抗体与其他黄病毒有广泛的交叉反应，尤与登革病毒的交叉反应最强。由于Zika病毒与登革病毒具有高度的抗原相似性，历史上的多起Zika病毒病疫情在暴发初期均被误诊为登革病毒传播，后通过核酸检测和序列分析才完成最终鉴定。研究还发现，初次和再次感染者的IgM抗体交叉反应不同，初次感染的交叉反应最小；当Zika感染者曾感染其他黄病毒或二次感染Zika病毒时，IgM抗体交叉反应较强。

Duffy 等[27]利用PRNT90测定Zika病毒和登革病毒的中和抗体效价。Zika病毒中和抗体在初次感染者中高度特异，多数恢复期血清对异源黄病毒反应呈阴性，极少>10。但在二次感染患者(曾感染过Zika病毒或其他黄病毒)中，Zika病毒中和抗体效价更高，与其他黄病毒的交叉中和作用也更强。Lanciotti等[1]用PRNT90测定了7例患者的Zika病毒和黄病毒中和抗体，发现1例患者因以前接种黄病毒疫苗，Zika病毒感染后的恢复期血清对其他黄病毒的中和抗体效价明显增高，这与黄病毒的“抗原原罪”现象有关。因此，Dick等[28]认为Zika病毒中和抗体效价至少要达到20，同时Zika病毒与登革病毒等其他黄病毒中和抗体效价的差异至少要>4倍。

补体结合实验和血凝抑制实验等其他血清学诊断方法同样也存在Zika病毒与其他黄病毒的交叉反应。因此，在缺乏病毒核酸检测结果的情况下，基于上述方法的单次抗体检测结果均不能作为病例确诊依据，必须用同一病例的双份血清来确定。

基于不同的血清学检测原理，国外已研发了多种用于Zika病毒血清学检测的商业试剂盒。德国Euroimmun公司研发的基于Zika病毒NS1蛋白检测IgM和IgG的ELISA试剂盒可有效降低与其他黄病毒的交叉反应；该公司还研制了免疫荧光检测芯片，含有Zika病毒、登革病毒1～4型和基孔肯雅病毒感染的细胞，对西尼罗病毒、登革病毒、蜱传脑炎病毒的抗体有一定交叉反应。另外，美国MyBiosource公司开发了双抗原夹心法IgM和IgG抗体检测试剂盒，加拿大Biocan Diagnostic公司生产了基于NS1和膜蛋白利用指尖血检测IgM和IgG抗体的试剂盒[29]。目前国内还未有Zika病毒血清学检测试剂盒，引进或快速开发诊断试剂是当务之急。

4Zika病毒的分离和培养

病毒的分离和培养是国际上公认的病毒鉴定金标准。1947年4月从恒河猴血清中成功分离了第一株Zika病毒，1948年1月从非洲伊蚊中分离获得毒株，1954年终于从患者体内分离出了Zika病毒[23-25]。Zika病毒的分离和培养方法，主要包括小鼠颅内接种法、敏感细胞系分离培养法等。其中，利用敏感细胞系分离和培养Zika病毒的方法日益成熟，为疫情监测、疫苗研制和致病机制探索提供了更加便利的条件。

Dick等[28]从恒河猴血清中成功分离了第一株Zika病毒。他们以恒河猴血标本作为感染材料，对35～42日龄小鼠采用颅内、腹腔和皮下注射3种方式感染，感染后10 d小鼠出现临床症状，取患病小鼠脑组织匀浆过滤液，在小鼠进一步传代后分离获得Zika病毒。但通过腹腔注射感染小鼠和皮下注射感染猴，动物均未出现症状，也未获得病毒。人和非洲伊蚊体内的第一株Zika病毒也是通过小鼠颅内接种分离获得的[30-31]。

Perkasa等[32]利用Vero细胞系来分离和培养Zika病毒，将黄病毒核酸阳性标本接种至Vero单层细胞，培养10 d后可引起细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，分离物经两代培养后，病毒滴度可达7.33×106pfu。Hamel等[33]曾用C6/36细胞成功培养了Zika病毒。C6/36细胞是白纹伊蚊中分离获得的可传代细胞，具有与非洲伊蚊细胞相似的生物学性状，黄病毒科多数病毒对其敏感。另外，Hamel 等[33]对Zika病毒生物学功能的研究发现，真皮成纤维细胞、表皮角质细胞和不成熟树突细胞(dendritic cell，DC)可作为Zika病毒的复制场所，磷脂酰丝氨酸受体Axl是Zika病毒进入细胞的受体，细胞自噬体能加强Zika病毒复制。

综上所述，病毒分离和培养虽耗时费力，无法满足临床对快速诊断的需求，但病原分离鉴定仍是确定病原体的金标准。另外，分离获得的毒株对后续病毒生物学特性研究、疫苗和药物研发必不可少，因此病毒的分离和培养具有不可替代的价值和意义。

5结语

Zika病毒感染者多数无临床症状，发病者症状也较轻，极少死亡。以往虽有暴发疫情，但未获得国际上的广泛重视。Zika病毒相关诊断技术、治疗药物和疫苗研究均较少，国内外尚缺乏通过可靠验证的病原学或血清学诊断试剂。最近研究提示，新生儿小头畸形与孕妇感染Zika病毒之间存在相关性，因此临床实验室诊断的重点在于及时确认孕妇及胎儿感染。然而，目前除病毒核酸和IgM抗体检测方法相对成熟外，国际上仅有少数实验室可开展用于鉴别诊断的中和抗体试验，而羊水、脐带血、胎盘等标本中的病毒核酸和抗原检测相关技术也急需建立和应用。目前，随着全球对Zika病毒病疫情的关注，多种标准化的诊断试剂有望在近期问世并在临床使用。

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Laboratory diagnosis of Zika virus infection

SONG Zhigang1,*, WANG Wei1,*, HU Yunwen1,2

1. Department of Pathogen Detection and Biological Safety, Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China; 2. Department of Medical Microbiology and Parasitology, Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Zika virus (ZIKV) is an arthropod-borne virus of the family Flaviviridae. Recently，the virus caused a large scale epidemic in Americas with a trend of global spreading, and constituted a Public Health Emergency of International Concern (PHEIC). The diagnosis of Zika virus disease is mainly based on the pathogen detection in the laboratory. In this review, the present methodologies of Zika virus detection including nucleic acid detection, serological detection, and virus isolation are summarized.

Key words:Zika virus; Laboratory detection; Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

基金项目：“十三五”国家科技重大专项(2016ZX10004-211)

通信作者：胡芸文

Corresponding author. HU Yunwen, E-mail: ywhu0117@126.com

(收稿日期：2016-03-18)

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