红车轴草异黄酮对认知损害大鼠NF-κB信号通路及突触可塑性的调节作用

卢盛娟　林　兴　雷丹青

(广西医科大学，广西　南宁　530021)

红车轴草异黄酮对认知损害大鼠NF-κB信号通路及突触可塑性的调节作用

卢盛娟林兴雷丹青

(广西医科大学，广西南宁530021)

〔摘要〕目的探讨红车轴草异黄酮对Aβ1～42致大鼠认知功能损害的保护作用。方法将75 只Wistar大鼠随机分为五组，除假手术组外，其余大鼠海马双侧注射Aβ1～42肽建立认知功能损伤模型，治疗组灌胃给予红车轴草异黄酮，连续3 w。采用免疫组织化学法检测各组大鼠海马神经元退行性。TUNEL法测定各组大鼠海马神经细胞的凋亡率；ELISA实验检测各组大鼠海马组织中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达情况；Western印迹法检测海马组织中核因子(NF)-κB信号通路相关蛋白和突触可塑性相关蛋白的表达情况。结果红车轴草异黄酮能改善Aβ1～42致大鼠的学习记忆障碍。进一步研究表明，红车轴草异黄酮可显著减弱海马神经元退行性，降低Aβ1～42致海马IL-1β和TNF-α的过度表达；减弱星形胶质细胞和小神经胶质细胞的增生，明显抑制海马NF-κB的活化。此外，红车轴草异黄酮还可增加突触可塑性相关蛋白和脑源性营养因子(BDNF)水平。结论红车轴草异黄酮对Aβ1～42诱导的学习和记忆损伤有明显改善作用，其机制可能与抑制NF-κB活化，减少神经炎症、调节突触可塑性相关蛋白的表达，以及提高BDNF水平有关。

〔关键词〕红车轴草异黄酮；认知功能损害；核转录因子-κB；脑源性营养因子；突触

1材料与方法

1.1药物和试石杉碱甲阳性对照药〔4〕，购自重庆市渝中制药厂；红车轴草异黄酮购自南宁千金子中草药有限公司；Aβ1～42肽(美国Sigma-Aldrich公司)，溶解于0.1 mmol/L无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)配成1 μg/μl的浓度。

1.2实验动物及给药Wistar大鼠，SPF级，10周龄，体质量(300±20)g，由广西医科大学实验动物中心提供。大鼠75 只随机分为假手术对照组、Aβ1～42处理组、石杉碱甲(0.05 mg/kg)阳性对照治疗组、红车轴草异黄酮(10 mg/kg)低剂量组、红车轴草异黄酮(20 mg/kg)高剂量组。参照已有的研究，于Aβ1～42处理组大鼠海马双侧立体定向注射Aβ1～42肽2 μl(1 μg/μl)〔5〕。假手术对照组，注射相同体积的PBS。各组动物在同样条件下饲养1 d后，石杉碱甲治疗组和红车轴草异黄酮治疗组分别灌胃给予石杉碱甲(0.05 mg/kg)和红车轴草异黄酮(10、20 mg/kg)；假手术对照组和Aβ1～42处理组，均给予等体积生理盐水，每天灌胃1次，连续3 w。

1.3脑组织病理检查首先取部分脑组织马上放入4%的多聚甲醛溶液，常规脱水、石蜡包埋，组织切片，H-E染色，于光学显微镜下观察。

1.4大鼠海马神经细胞凋亡的检测采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)。将生长于24孔板中盖玻片上不同条件下培养的大鼠海马神经细胞用0.1%的NaBH 4和0.1%的Triton X-100处理过的细胞用4%多聚甲醛固定后，40 μm冷冻切片，将载玻片与含有脱氧核糖核酸末端转移酶和异硫氯酸荧光-邻苯二甲酸二十一烷茎酶(FITC-DUDP)的混合物培养反应 1 h。用 4'-6'-二脒基-2-苯基吲哚二氢氯化物吲哚(DAPI)进行染色，每份样品随机选取视野，然后于荧光显微镜下分析计数，计算细胞凋亡指数。

1.5大鼠海马中白细胞介素(IL)-1β，肿瘤坏死因子(TNF)-α活性的检测采用夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA法)进行测定，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6Western印迹检测海马组织中核转录因子(NF)-κB信号通路相关蛋白和突触可塑性相关蛋白的表达采用Western印迹检测NF-κB p65，磷酸化NF-κBp65，IκBα，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，凝集素B4(IB4)，突触泡蛋白，p-IκBα的表达，以β-actin作为内参，用图像处理系统进行分析。检测方法参见文献〔6〕。

2结果

2.1红车轴草异黄酮对神经元退行性的影响Aβ1～42处理组大鼠神经元表现出嗜酸变性，核固缩和神经元序列错乱。红 车轴草异黄酮(20 mg/kg)治疗组与Aβ1～42处理组比较，神经元退行性得到缓解(P<0.05)。见图1。

2.2红车轴草异黄酮对海马神经细胞凋亡数的影响Aβ1～42处理组与假手术对照组比较，海马凋亡细胞显著增加。经红车轴草异黄酮或石杉碱甲治疗后Aβ1～42所致的细胞凋亡数显著减少。见图2。

这款众泰E200纯电动车，采用的是杭州杰能动力有限公司提供的动力电池组，其电能量为24.5kWh，最大持续工作电流为75A，工作电压范围为264～369V。通过BMS实测电池组的总电压较低，不在规定范畴内。正常情况下，单体电池电压一般为3.64V左右，变化范围为3.0～4.2V。但在检测时(图3)，却发现有的单体电池的电压已高达6.40V(图4)，这是极不正常的情况。动力电池整体电压偏低，而某些单体电池电压异常偏高，说明电池组已出现部分异常损坏。

2.3红车轴草异黄酮对TNF-α和IL-1β蛋白表达的影响见表1。Aβ1～42处理的模型组与假手术对照组比较，海马组织IL-1β和TNF-α蛋白表达显著增加(P<0.05)。Aβ1～42诱导的大鼠IL-1β和TNF-α水平增加，而用红车轴草异黄酮治疗后IL-1β和TNF-α水平显著降低。

①假手术对照组；②Aβ1～42处理组；③石杉碱甲治疗组；④低剂量红车轴草异黄酮治疗组；⑤高剂量红车轴草异黄酮治疗组；下图同图1　红车轴草异黄酮对神经元退行性的影响(HE，×400)

图2　红车轴草异黄酮对海马神经细胞凋亡数的影响(TUNEL法，×200)

组别TNF-αIL-1β假手术对照组38.5±4.31)26.8±3.91)Aβ1～42处理组298.9±20.6212.5±20.4石杉碱甲治疗组214.8±18.81)157.6±16.21)低剂量红车轴草异黄酮治疗组153.5±16.61)123.2±10.31)高剂量红车轴草异黄酮治疗组125.9±13.81)98.9±8.41)

与模型组比较：1)P<0.05；下表同

2.4红车轴草异黄酮对NF-κB活性的影响Aβ1～42诱导的大鼠模型组与假手术对照组比较，海马NF-κBp65，P-p65蛋白表达显著升高，而给予红车轴草异黄酮治疗后，其蛋白表达均显著降低，红车轴草异黄酮能明显促进IκBα蛋白的表达和抑制IκBα的磷酸化。见表2，表3。

表2　Western印迹法检测海马组织中

表3　Western印迹法检测海马组织中IκBα与

2.5红车轴草异黄酮对突触泡蛋白水平的影响Aβ1～42诱导的大鼠模型组突触泡蛋白水平(0.29±0.02)比假手术对照组(0.63±0.03)显著降低，而用红车轴草异黄酮治疗后，突触泡蛋白水平呈显著增加(低、高剂量组分别为0.51±0.04、0.58±0.04)，且石杉碱甲也不能增加突触泡蛋白水平(0.36±0.03)。

2.6红车轴草异黄酮对BDNF的影响BDNF集中分布在海马组织中。同时，Aβ1～42诱导的大鼠模型组，BDNF蛋白表达(0.11±0.03)较假手术对照组(0.38±0.02)显著减少，红车轴草异黄酮能阻碍Aβ1～42诱导的BDNF水平降低(低、高剂量组分别为0.17±0.03、0.22±0.03)，石杉碱甲不能提高BDNF水平(0.16±0.03)。

2.7红车轴草异黄酮对胶质的影响Aβ1～42导致小胶质细胞和星形胶质细胞大量活化，从而增加GFAP和IB4水平。红车轴草异黄酮能显著降低GFAP、IB4水平；同时，石杉碱甲不能抑制两者水平。见表4。

表4　Western印迹法检测海马组织中

3讨论

Aβ1～42是AD形成和发展的关键因素，是诱发AD的多种原因的共同病理基础〔7〕。前期实验已证实，降低Aβ1～42在大脑内的蓄积量可以缓解并减轻AD的症状。故本实验考虑采用Aβ1～42建立认知功能损伤动物模型。

AD的发病机制尚不清楚，目前普遍认为Aβ是治疗AD的有效靶分子〔8〕。石杉碱甲是从民间草药千层塔(蛇足石杉,Huperzia serrata)中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体〔9〕。近年研究发现,石杉碱甲通过提高抗氧化酶活力，具有明显的抗Aβ毒性作用〔10〕。石杉碱甲对比已经上市的治疗AD药物E2020，他克林，毒扁豆碱等，能更好地改善老年记忆力衰退，对AD有很好的疗效〔11〕。因此，选用石杉碱甲作为本实验治疗Aβ1～42所致大鼠记忆和认知功能障碍的阳性药。

Aβ1～42主要是通过细胞内激活胱天蛋白酶-3〔12〕途径引发细胞凋亡。本实验中Aβ1～42处理组可见大量凋亡神经细胞，经红车轴草异黄酮或石杉碱甲治疗后，凋亡数显著减少。提示红车轴草异黄酮能显著减弱海马神经元退行性。

IL-1β介导AD的炎症反应过程，并处于炎症反应链的前端，是炎症级联反应中重要的始动因子,可进一步促进其他炎症介质的合成和释放，如IL-6、NF-κB、TNF-α〔13〕。BDNF是由119 个氨基酸组成的碱性蛋白，作为神经营养因子家族的重要成员，BDNF〔14〕在成年期中枢神经系统多个脑区调节突触传递和突触可塑性，参与学习和记忆的形成，并改善记忆，恢复受损的认知功能。通过研究发现，Aβ1～42处理组IL-1β、TNF-α、NF-κB大量表达，而BDNF表达量降低，红车轴草异黄酮组其表达量情况刚好与Aβ1～42处理组相反，可见改善大鼠认知功能损害与红车轴草异黄酮促进 BDNF的表达，抑制IL-1β、TNF-α的表达和NF-κB的活化密切相关。

近年研究表明，随着年龄增长而记忆功能逐渐下降的原因是由于突触功能的退化，而不是神经元的缺失〔15〕。Aβ的突触毒性可能导致记忆障碍。在实验模型中，发现Aβ1～42能引起海马突触泡蛋白水平显著降低，而突触泡蛋白是一种特定突触前标记物，这与前期研究发现的Aβ侧脑室注射产生突触毒性有关〔16〕。本实验显示，给予红车轴草异黄酮治疗后突触泡蛋白的表达显著升高，表明红车轴草异黄酮对海马完整突触的保护作用可能是其改善认知功能恶化的神经生物学基础的结果。

中枢炎症反应与周围炎症反应不同，脑中枢具有自己的免疫系统。小胶质细胞是中枢免疫细胞，正常状态下，“静息”的小胶质细胞连续“监测”机体中枢神经系统，当受刺激后迅速激活，诱发炎性反应。实验中，用红车轴草异黄酮可一定程度抑制小胶质细胞过度激活及中枢炎症反应，而使用GFAP和IB4石杉碱甲不能抑制小胶质细胞激活及炎症反应，两种药物对术后认知影响还需进一步研究，但通过实验我们可以推测AD与显著减弱星形胶质细胞和小神经胶质细胞的增生有关。

综上所述，红车轴草异黄酮可明显减轻Aβ1～42诱导的大鼠学习和记忆损害，初步的机制研究证实，该异黄酮能抑制NF-κB的活化、减少神经炎症、提高突触可塑性相关蛋白的表达、提高BDNF的水平。

4参考文献

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〔2015-10-15修回〕

(编辑袁左鸣)

Regulative mechanism of pratensein on NF-κB signaling pathway and synaptic plasticity in cognitive impairment rats

LU Sheng-Juan,LIN Xing,LEI Dan-Qing.

Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of pratensein against cognitive impairment induced by Aβ1～42in rats.MethodsSeventy-five rats were randomly divided into five groups.Except the sham control group,all the rats in the other groups were injected bilaterally in the hippocampus with Aβ1～42peptide to establish the model of cognitive impairment.Then the rats in the treatment groups were administered orally pratensein for 3 weeks.The neuronal degeneration and neuronal apoptosis in hippocampus were detected by immunohistochemistry and TUNEL assays,respectively.The levels of NF-κB and synaptic-associated proteins were examined by Western blot.In addition,the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsPratensein treatment significantly ameliorated learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats.The further mechanism study indicated that pratensein significantly reduced the neuronal degeneration and apoptosis in hippocampus.Moreover,treatment with pratensein significantly decreased the contents of IL-1β and TNF-α,and inhibited the proliferations of astrogliosis and microgliosis in hippocampus.Pratensein could significantly suppress the activation of NF-κB in hippocampus.In addition,pratensein was able to enhance the levels of synaptophysin and brain-derived neurotrophic factor(BDNF).ConclusionsPratense can improve the learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats,and its mechanism may be relate to the inhibition of neuronal inflammation by suppressing NF-κB activation,and the up-regulations of synapse-related proteins and BDNF level.

【Key words】Pratensein;Cognitive impairment;NF-κB;Brain-derived neurotrophic factor;Synapsis

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81260674)；广西自然科学基金资助项目(No.2013GXNSFAA019146)

通讯作者：雷丹青(1963-)，男，研究员，硕士生导师，主要从事天然药物提取、分离及其应用方面的研究。

〔中图分类号〕R74

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2318-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.004

第一作者：卢盛娟(1989-)，女，硕士，主要从事生化药理学研究。