嗜肺军团菌momp基因疫苗的制备及其免疫原性研究*

窦娇莹，杨志伟

(1.甘肃省中医院检验科，兰州 730050;2.宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，银川 750004)

·论著·

嗜肺军团菌momp基因疫苗的制备及其免疫原性研究*

窦娇莹1,2，杨志伟2

(1.甘肃省中医院检验科，兰州 730050;2.宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，银川 750004)

摘要:目的构建真核重组质粒GFP-momp作为核酸疫苗，已构建的原核重组质粒pET-momp表达的蛋白作为蛋白疫苗，二者联合免疫BALB/c雌性小鼠，观察其免疫原性。方法(1)以嗜肺军团菌DNA作为模板，扩增得到momp基因，并克隆至pEGFP-C1载体获得重组质粒GFP-momp。鉴定正确后，将其转染到NIH3T3细胞，利用荧光显微镜观察GFP-momp的表达。(2)选取BALB/c雌性小鼠60只,平均分为4组,即磷酸盐缓冲液(PBS)组(A组)、空质粒pEGFP-C1组(B组)、DNA疫苗组(C组)、联合疫苗组(D组)。以重组质粒GFP-momp作为DNA疫苗，重组质粒GFP-momp和MOMP蛋白作为联合疫苗，第1天A组肌肉注射PBS 50 μL，B组注射pEGFP-C1 50 μg，C、D组各注射GFP-momp 50 μg；第14天各组以相同剂量追加免疫1次；第21天A、B、C组用相同剂量再追加免疫1次，D组注射10 μg纯化的MOMP蛋白。借助对各试验组小鼠的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等指标的动态检测，来评价DNA疫苗与蛋白疫苗的免疫原性。结果扩增出831 bp的momp基因，构建重组质粒GFP-momp，转染入NIH3T3细胞并在细胞内表达出绿色荧光蛋白。在淋巴细胞增殖试验中：A组和B组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C组和D组淋巴细胞增殖活性均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；C组高于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。间接ELISA测定血清中抗原特异性抗体水平结果显示，A、B两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C、D两组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组抗体滴度高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。CTL杀伤活性试验结果显示，A、B两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C、D两组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)； D组杀伤活性高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建momp基因的真核表达载体并在NIH3T3细胞中得到表达，并进一步得出嗜肺军团菌momp基因诱导产生的DNA疫苗和DNA-蛋白疫苗均能产生细胞免疫和体液免疫，具有免疫原性。

关键词:嗜肺军团菌；momp基因；疫苗

军团菌是存在于天然水和土壤中的胞内寄生菌，广泛存在于潮湿含铁的管道,如空调、淋浴器等与人类生活密切相关的地方,大大增加了人类与该菌的接触概率[1]。人畜可因吸入含军团菌的气溶胶而感染。作为胞内寄生菌，军团菌可借助侵入宿主的巨噬细胞来逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用，并在宿主细胞中生长繁殖。目前已知的军团菌以嗜肺军团菌(Lp)1型最为常见，它是引起社区获得性肺炎和院内感染肺炎的重要病原菌[2]。军团菌感染目前没有有效的特异性预防措施，因此，研究高效的疫苗已成为现阶段临床的迫切需求。本研究利用生物及免疫信息学方法进行比对分析后发现，主要外膜蛋白(MOMP)是基因表达的相对分子质量为30×103的外膜蛋白，具有良好的免疫原性。本研究拟构建重组质粒GFP-momp作为DNA疫苗对小鼠进行免疫，已构建的重组质粒pET-momp诱导表达的重组蛋白MOMP作为蛋白疫苗，观察该基因的免疫原性，为疫苗方面的研究奠定基础，现报道如下。

1材料与方法

1.1菌株和质粒Lp 1型菌株由四川大学陈建平教授惠赠；重组MOMP蛋白由作者前期构建。EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自fermentas公司；DNA 提取及纯化试剂盒购于北京天根公司；质粒提取试剂盒购自 Omega 公司。试验动物：BALB/c雌性小鼠，6～8周龄，SPF级，体质量约18 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号：0239997。

1.2方法

1.2.1Lp基因组DNA的提取参考DNA提取试剂盒操作步骤进行。

1.2.2Lpmomp基因的PCR扩增根据Pub Med相关文献的momp基因序列，设计并合成引物，分别在5′端加上EcoRⅠ和HindⅢ内切酶位点。 上游 5′-ATA ATA TAG GAA TTC GGT ACG ATG GGT CCA GTA TG-3′ ，下游 5′-CCC AAG CTT TTA GAC ATT GCC AAC ATA TTT TAA GC-3′。PCR扩增体系：基因组DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq mix 25 μL，无RNA酶水22 μL。扩增条件：95 ℃ 预变性5 min； 95 ℃ 变性30 s； 48 ℃退火45 s； 72 ℃延伸1.5 min；30 个循环； 72 ℃总延伸7 min。

1.2.3提取质粒pEGFP-C1按照质粒提取试剂盒操作步骤提取质粒pEGFP-C1。

1.2.4momp重组质粒的构建用EcoRⅠ和HindⅢ对扩增的momp基因和载体pEGFP-C1进行双酶切，在16 ℃下进行连接，转化于制备好的感受态细胞，均匀涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37 ℃培养12 h。

1.2.5阳性重组克隆的筛选、鉴定将单个菌落接种于含有卡那霉素的LB培养液中，培养并提取质粒，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ进行单、双酶切鉴定。以酶切鉴定阳性的重组质粒为模板，扩增后电泳观察。

1.2.6重组质粒序列测定取鉴定阳性的重组质粒菌体，送上海生工生物技术公司进行测序。

1.2.7转染将鉴定正确的含重组GFP-momp、空质粒pEGFP-C1的单个菌落增菌，按试剂盒说明书提取无内毒素质粒用于转染。同时将处于对数期的NIH3T3细胞种于24孔细胞培养板，每孔约1×106个，培养至细胞达板底面积80%时用于转染。试验分正常NIH3T3细胞组、空质粒PEGFP-C1组、重组GFP-momp组。

1.2.8重组质粒在细胞中的筛选及表达转染48 h后用300 μg/mL的G418进行筛选，并于72 h后检测GFP-momp在细胞中的瞬时表达。

1.2.9动物免疫取BALB/c雌性小鼠60只，平均分为4组，即PBS组(A组)、空质粒pEGFP-C1组(B组)、DNA疫苗组(C组)、联合疫苗组(D组)。采用肌肉注射法进行免疫接种。第1周A组每只小鼠注射PBS 50 μL，B组每只注射空质粒pEGFP-C1 50 μg，C组注射重组质粒GFP-momp50 μg，D组注射重组质粒GFP-momp50 μg；第14天各组相同剂量追加免疫一次；第21天A、B、C组用相同剂量追加免疫1次，D组注射10 μg 纯化的MOMP蛋白。

1.2.10用间接ELISA检测血清中特异性抗体取免疫后第14、21、28天每组各5只小鼠，眼部采血，以纯化后MOMP蛋白作为包被抗原。测定血清中抗原特异性抗体水平，并设阴性对照孔。若阳性对照孔平均OD值/阴性对照孔平均OD值大于2.1则判断为阳性，出现阳性反应的待测血清最高稀释度即为抗体滴度。

1.2.11检测细胞免疫反应开始免疫后第14、21、28天，每组分别取5只小鼠，无菌条件下取出脾脏，制成细胞悬液。细胞活性大于95%以上备用。

1.2.12检测淋巴细胞增殖活性(MTS法)调整脾淋巴细胞浓度至1×106/mL，100 μL/孔加到96孔板，分别加ConA(终浓度5 μg/mL)，并设对照孔(不加ConA)。每只小鼠3个复孔，在37 ℃,5% CO2孵箱中培养72 h。吸取20 μL的 CellTiter 96®Aqueous试剂到含有100 μL培养液的细胞中培养4 h。测量OD值。计算刺激指数(SI)作为淋巴细胞增殖程度的指标。SI=试验孔OD值/对照孔OD值的均值

1.2.13细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测(LDH法)以重组GFP-momp转染出的阳性细胞作为检测CTL杀伤活性的靶细胞。PBS组、空质粒组、重组GFP-momp组、GFP-momp/MOMP蛋白组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞。调整效应细胞与靶细胞的细胞数之比为10∶1，并设效应细胞、靶细胞对照孔及空白对照孔，均设3个平行孔。同时设靶细胞LDH自然释放孔，靶细胞+100 μL RPMI1640；靶细胞LDH差异最大释放孔，靶细胞+90 μL RPMI1640+10 μL裂解液；效应细胞LDH自然释放孔，100 μLRPMI1640 的效应细胞。37 ℃孵育4 h。加入相应底物50 μL，避光孵育30 min。加50 μL终止液，测量490 nm处的OD值。

2结果

2.1重组质粒GFP-momp的PCR扩增结果用引物对重组GFP-momp进行扩增,得到约800 bp大小的产物(图1)。

注：M为DL2000 marker;1为 PCR产物;2为阴性对照。

图1GFP-momp基因的PCR 扩增产物

2.2GFP-momp的酶切鉴定用HindⅢ对质粒单酶切，得到5 500 bp左右的产物；用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，同一泳道出现4 700 bp和800 bp两种产物，并与pEGFP-C1空质粒及momp基因位置相一致(图2)。

注：M1为1kb marker；1为HindⅢ单酶切GFP-momp产物；2为 HindⅢ和EcoRⅠ双酶切GFP-momp产物；3为HindⅢ单酶切pEGFP-C1产物;4为 PCR产物；M2为DL2000 marker。

图2重组质粒GFP-momp的酶切结果

2.3荧光显微镜下观察结果在荧光显微镜下发现被重组质粒GFP-momp转染的NIH3T3胞浆中有较强的绿色荧光，同一视野下可见清晰的细胞形态，证实重组质粒GFP-momp转染成功。同时空质粒pEGFP-C1转染的细胞和正常细胞对照组均未见绿色荧光(图3)。

2.4小鼠体内抗原特异性抗体滴度检测见表1。开始免疫后第14、21、28天小鼠内眦采血分离血清，采用ELISA测定血清中抗原特异性抗体水平。检测结果显示，A组和B组比较差异无统计学意义(P>0.05)，且A、B两组组内分析后差异也无统计学意义(P>0.05)。C组和D组滴度大于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组比C组抗体水平高，差异有统计学意义(P<0.05)，且C组和D组组内分析显示，随免疫时间延长，抗体滴度也随之增大，差异有统计学意义(P<0.05)。

注： a为重组质粒GFP-momp转染的NH3T3细胞的表达(荧光)；b为重组质粒GFP-momp转染的NH3T3细胞的表达(普光)；c为空质粒pEGFP-C1转染的NH3T3细胞(荧光)；d为空质粒pEGFP-C1转染的NH3T3细胞(普光)；e为正常细胞对照组(荧光)；f为正常细胞对照组(普光)。

图3　荧光显微镜检测重组质粒GFP-momp在

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

2.5用MTS法检测淋巴细胞增殖活性SI值见表2。开始免疫后第14、21、28天动态检测结果显示，A组和B组淋巴细胞增殖活性SI值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且A、B两组组内分析后差异也无统计学意义(P>0.05)。C组和D组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)； D组比C组活性高，差异有统计学意义(P<0.05)，且C组和D组组内分析显示，随免疫时间延长，增殖活性SI值随之增大，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2　　4组开始免疫后第14、21、28天小鼠淋巴细胞

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

2.6CTL杀伤活性检测见表3。开始免疫后第14、21、28天，检测CTL杀伤活性，检测结果显示，A组和B组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且A、B两组组内分析后差异也无统计学意义(P>0.05)。C组和D组杀伤活性大于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组比C组杀伤活性高，差异有统计学意义(P<0.05)，且C组和D组组内分析显示，随免疫时间延长，杀伤活性也随之增大，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3　　4组开始免疫后第14、21、28天小鼠CTL

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

3讨论

细菌的外膜蛋白(OMP)在细菌致病过程中起重要作用，因为其不仅可刺激体液免疫，也可刺激细胞免疫，显示了良好的免疫原性[3]。目前，军团菌疫苗中的DNA疫苗作为第3代疫苗已引起人们的广泛关注，且DNA疫苗具有容易获取，使用安全，保存容易等优点，还可以用其他疫苗来加强免疫效果。目前美国食品药品监督管理局批准HIV、埃博拉病毒、疟疾等多种DNA疫苗进入临床试验[4]。核酸疫苗引发的免疫应答相对较弱，尤其在大动物及人体内不足以引起足够的免疫保护效果[5]。所以研究发现了多种提高核酸疫苗免疫效果的方法，其中用一种疫苗进行初始免疫，再用另一种或多种不同类型的疫苗进行加强免疫，即Prime-Boost免疫策略通常会产生比单一疫苗更强的免疫反应，特别是能产生更强的细胞免疫应答[6]。在诱导细胞免疫应答方面有比较好的作用，并显示了很好的应用前景。本研究将所构建的重组质粒GFP-momp作DNA疫苗及重组质粒pET-momp表达的蛋白作为蛋白疫苗，对小鼠进行免疫，检测其体内细胞免疫、体液免疫的相关性指标，结果初步分析表明，使用不同的免疫策略，产生的免疫应答方式和强度有所不同。C、D两组抗体滴度水平均高于A、B两组，说明C、D两组均能产生较好的特异性抗体；但D组抗体水平只略高于C组，这可能是因为D组与C组相比只进行了一次蛋白免疫；C、D两组在动态监测抗体水平的情况下，组内也有差异，推测该值随时间增加抗体也会增加，这与Ferraz等[7]所得结果一致。然而，细胞免疫应答方面的结果却有所不同，C、D两组细胞免疫水平均高于A、B两组，说明C、D两组均能产生较好的细胞免疫；但是与C组相比较，D组细胞免疫水平明显高于C组，分析其原因可能是因为二者采用了不同的免疫方法，前者为单一的DNA免疫，后者为Prime-Boost免疫策略；且C、D两组组内同一时间点的数据水平也随免疫时间增加而相应提高。以上结果与Prime-Boost策略的基本原理相符，且与Ferraz等[7]采用表达结核杆菌Apa(富含丙氨酸-脯氨酸的抗原)、Hsp 65和Hsp 70的DNA疫苗初次免疫、卡介苗加强的策略免疫小鼠及Belyakov等[8]用DNA疫苗初次免疫、重组MVA病毒加强免疫研究初次免疫-加强免疫策略结果一致。同时，张璐等[9]在DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫对HIV包膜蛋白gp120体液免疫的影响中证实，DNA和蛋白疫苗共同免疫有利于提高艾滋病疫苗诱导的抗体反应水平。另外，其他一些研究小组结果也显示Prime-Boost策略可以明显提高疫苗的保护效果[10-11]。 Lp作为一种胞内寄生菌，其感染机体后产生的免疫应答主要是细胞免疫，结果显示Prime-Boost策略能产生较好的细胞免疫应答，有助于胞内菌的预防。

本研究结果表明，以Prime-Boost免疫策略为依据的DNA疫苗初次免疫，蛋白疫苗加强免疫的方法使Lp感染后的抗体水平有所提高，对淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性也明显提高。

因此，momp基因制备的DNA疫苗对小鼠有免疫原性，为Lp有效疫苗的研究提供了理论依据及应用价值。

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Preparation and immunogenicity ofmompgene vaccine of Legionella Pneumophilia*

DOUJiaoying1,2,YANGZhiwei2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ChineseTraditionalChineseMedicineofGansu,Lanzhou730050,China; 2.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the immunogenicity of the DNA vaccine induced by eukaryotic recombinant plasmid GFP-momp combined with protein vaccine induced by prokaryotic recombinant plasmid pET-momp in BALB/c female mice immunized intramuscularly.MethodsThe MOMP gene amplified from DNA of Legionella pneumophila by PCR were cloned into pEGFP-C1 vector,which produced the recombinant plasmid named as GFP-momp.GFP-momp was analyzed with restriction endonuclease digestion,PCR and DNA sequencing techniques.The NIH3T3 cell was transfected by recombinant plasmid GFP-momp through lipofection.The stable expression products of MOMP were observed by the fluorescent microscope.Sixty BALB/c female mice were divided into 4 groups averagely,the PBS control group (A group),the plasmid pEGFP-C1 control group (B group),DNA vaccine experimental group (C group) and the combination vaccine experimental group (D group).By recombinant plasmid the GFP-momp combined with MOMP protein,mice of group A were given intramuscular injection PBS 50 μL and mice of group B were injected with pEGFP-C1 50μg.In addition,mice of group C and D were injected GFP-momp 50 μg in the first day.Each group injected the same dose immunization once in the fourteenth day.Then mice of group A,B and C were injected with the same dose of an additional immunization and in the twenty-first day and that of the group D were injected with 10 μg purified MOMP protein.Then antibody levels,lymphocyte proliferation activity and CTL killing activity were tested to evaluate the immunogenicity of DNA vaccines and combined vaccine.Results831 bp momp gene was amplified.Under the fluorescent microscope,green fluorescent was observed in the cell cytoplasm.In the lymphocyte proliferation test,there was no significant difference between group A and B (P>0.05).Proliferative activity of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05).And proliferative activity of group C was significantly higher than that of group D (P<0.05).The indirect ELISA results showed that antigen-specific levels of serum antibody in A Group and B Group had no significant difference (P<0.05).And the levels of serum antigen-specific antibody of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05).Antibody titer of group D was significantly higher than that of group C (P<0.05).CTL killing activity experiments showed that there was no significant difference between group A and B (P>0.05).The activity of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05) and the activity of group D was also significantly than that of group C (P<0.05).ConclusionThe recombinant plasmid GFP-momp is constructed and expressed successfully in the NIH3T3 cells.DNA vaccine and DNA protein vaccine induced by Legionella pneumophila bacteria momp gene have immunogenicity which can generate cellular and humoral immune responses.

Key words:Legionella pneumophila;momp gene;vaccine

* 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30860264)。

作者简介：窦娇莹，女，技师，主要从事微生物与免疫学检验研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.001

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)11-1449-04

(收稿日期：2016-01-28修回日期：2016-03-22)