氢化可的松致SD大鼠肾阳虚证卵巢早衰模型研究*

王　凯，刘帅帅，郭起岳，冷　平，蒋芳菲，孙晓生

1.广州中医药大学 基础医学院(广州　510006); 2.刘敏如女科医系研究院(深圳　518000);3.广东省医学实验动物中心(佛山　528248); 4.成都中医药大学(成都 610075); 5.广州中医药大学(广州　510006)

氢化可的松致SD大鼠肾阳虚证卵巢早衰模型研究*

王凯1,2，刘帅帅1，郭起岳3，冷平4，蒋芳菲4，孙晓生5△

1.广州中医药大学 基础医学院(广州510006); 2.刘敏如女科医系研究院(深圳518000);3.广东省医学实验动物中心(佛山528248); 4.成都中医药大学(成都 610075); 5.广州中医药大学(广州510006)

【摘要】目的探讨氢化可的松致SD雌性大鼠肾阳虚证卵巢早衰(POF)模型的大体情况、卵巢指数、子宫指数、动情周期紊乱情况、血清生殖激素水平的特征。方法以8～9周龄SPF级成年性成熟雌性SD大鼠(未孕未产)为研究对象，模型组每日上午后下肢肌注氢化可的松32 mg·kg-1·d-1，1次/d，连续12 d，建立肾阳虚证大鼠POF模型，对照组为未注射氢化可的松的雌性SD大鼠。分两个阶段观察比较在造模结束后第2天、第14天两组在大鼠体质量、卵巢指数、子宫指数、动情周期、血清生殖激素水平的变化。结果1)模型组大鼠第一阶段和第二阶段注射氢化可的松后体质量均低于对照组和注射前(P<0.05)，第一阶段和第二阶段体质量差异无统计学意义(P>0.05)；2)模型组大鼠动情周期紊乱，阴道涂片显示动情间期持续或延长；3)模型组大鼠第一阶段和第二阶段注射氢化可的松后卵巢指数均低于对照组和注射前(P<0.05)，第二阶段卵巢指数均数低于第一阶段(P<0.05)，子宫指数无明显差异(P>0.05)。4)与对照组和注射前相比，模型组大鼠第一阶段和第二阶段注射氢化可的松后血清E2下降，FSH、LH升高，FSH/LH升高，差异有统计学意义(P<0.05)；5)与模型组第一阶段相比，第二阶段血清E2下降，FSH/LH下降，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组两个阶段的FSH、LH差异无统计学意义(P>0.05)。结论氢化可的松致大鼠肾阳虚卵巢早衰模型大鼠体质量下降，呈明显阳虚证型，动情周期紊乱，动情间期延长或持续，卵巢指数降低，在给药结束后生殖激素异常，且在给药结束后14 d肾阳虚证持续。

【关键词】氢化可的松；肾阳虚证；卵巢早衰；动情周期；模型

卵巢早衰[1-3](premature ovarian failure,POF)是指女性40岁以前出现绝经或下丘脑性闭经，伴见围绝期症状群，具有高促性腺激素和低雌激素特征的妇科疑难病，是妇科内分泌领域的常见病，占妇女人群的1%～3%，卵巢早衰发病率有逐年上升和年轻化趋势[4-7]。中医妇产科中无卵巢早衰病名，但卵巢早衰症状与中医妇产科中不孕症、闭经、月经过少、血枯、未老经水断、绝经前后诸症等临床表现特点类似，中医肾阳虚证是上述中医病、症临床常见的病理状态之一，因此肾阳虚证也是卵巢早衰常见的证型之一。卵巢早衰动物模型国内外报道有很多种，比较常见的有化疗药物如环磷酰胺[8-10]、紫杉醇[11-12]、顺铂[12 ]等致卵巢早衰模型，中药雷公藤[13-14]也可致卵巢早衰，基因敲除卵巢可致早衰模型[15-16]，其他方法[17-20]如放射线、半乳糖血症、应激模型、超促排卵模型、高血压、自然衰老和药物去势等可致卵巢早衰模型。国内肾阳虚证造模方法很多，主要分为3大类[21]：药物干预，手术切除和模拟中医病因病机。陈英华等[22]研究指出，肾阳虚模型应从一般状态观察及试验检测、客观指标、药物反证,3个大的方面进行诊断；旺建伟等[23]研究认为，中医证模型具有中医理论特色，可以分为中医一般状态评价和借助现代医学方法学进行评价。在肾阳虚证药物造模中，氢化可的松是最早使用[21，23]且公认的造模药物[24-25]。肾阳虚模型的建立是探讨中医证候实质和中药药性实质的基础，也是现代中医药研究的重点，研究西医的病与中医证相结合的动物模型，是中西医结合研究的一种方法探讨。目前肾阳虚证卵巢早衰的动物模型报道并不多见，本研究试图建立氢化可的松致SD雌性大鼠肾阳虚证卵巢早衰模型，观察大鼠的大体情况、动情周期、卵巢指数、子宫指数和血清生殖激素等，为临床治疗肾阳虚证卵巢早衰探索实验基础。

1材料与方法

1.1材料

实验动物：SPF级SD雌性大鼠32只，购入体质量200～240 g，年龄8～9周龄，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2013-0002。主要实验仪器及试剂：氢化可的松注射液，批号1411403-A12，规格20 mL，100 mg，性状：无色澄明液体，生产单位：国药集团容生制药有限公司，购自广州中山医药有限公司；S-3000A电子天平：上海友声衡器有限公司，感量0.1 g；BS224S电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司，感量0.000 1g。自动放免仪：中国科大中佳公司，E2试剂盒，批号20151220，FSH、LH试剂盒，批号20160102，均购自北京北方生物技术研究所。

1.2实验方法

1.2.1检疫对购入SD大鼠检疫3 d。期间每日检查大鼠1次，如发现不健康大鼠立即剔除，选用健康大鼠进行实验。

1.2.2饲养动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房，识别方法：采用被毛染色法，使用饱和苦味酸对大鼠进行编号，在大鼠体表不同部位的被毛涂染斑点，以示不同号码。以大鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别。动物饲养条件：5～6只/箱， 群养。饲养温度与相对湿度：20～26 ℃，40%～70%，采用10 h∶14 h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证实验结果的可靠性。自由进食饮水，饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供。

1.2.3分组对购入SPF级成年性成熟雌性SD大鼠32只(未孕未产)，适应性饲养3 d后，将纳入实验的大鼠随机分为对照组16只、模型组16只。

1.2.4肾阳虚证POF造模模型组大鼠每日上午后下肢肌注氢化可的松32 mg·kg-1·d-1，1次/d，连续12 d。

1.2.5一般临床情况观察观察记录大鼠体形、被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸和进食等情况，同时观察是否出现外生殖器潮湿、阴道口变大、触之兴奋等动情期反应， 1次/d。

1.2.6体质量造模期及给药期，每5 d称量大鼠体质量1次，每周测量大鼠摄食量1次。

1.2.7动情周期检查从氢化可的松注射造模第一天起，每天上午抓取大鼠进行连续阴道涂片，性周期消失或动情间期持续或延长可确定造模成功。涂片在光镜下观察，根据阴道细胞形态判断大鼠动情周期。动情前期：光镜下以椭圆形有核上皮细胞占多数，白细胞和角质化上皮细胞很少；动情期：以片状角化上皮细胞为主，白细胞和有核上皮细胞很少，动情后期片状角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞均有，比例无明显异常；动情间期：白细胞占绝大多数，有核上皮和角质化上皮细胞很少[26]。

1.2.8相关激素检测于末次肌肉注射后第24 h(第一阶段)和第14天(第二阶段)，对照组和模型组各随机抽取8只大鼠进行取材检测。腹主动脉采血，离心取血清，放射免疫测定血清中E2、FSH和LH水平，计算FSH/LH值，激素检测委托广州中医药大学核医学教研室检测。

1.2.9大鼠子宫指数和卵巢指数测定采血后处死大鼠，取子宫及双侧卵巢，分别称取湿重后，按以下公式计算：子宫指数=子宫湿重(mg)/体质量(g)×100%；卵巢指数=卵巢湿重(mg)/体质量(g)×100%。

2结果

2.1大鼠的一般情况

模型组大鼠在首日注射氢化可的松1 h后，大部分动物随即出现精神萎靡、蜷缩、活动减少、嗜睡症状，持续注射氢化可的松后，大鼠精神萎靡，蜷缩怕冷症状逐渐加重，外观竖毛、毛无光泽、拱背少动、饮食减少、体质量降低、反应迟钝、呼吸深迟、肉眼未见外生殖器潮湿、阴道口变大、触之兴奋等动情期反应等。模型组大鼠体质量在造模前与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.28)。模型组大鼠在造模期和停止造模后体质量(P<0.001，<0.001，<0.001，<0.001，0.01，0.01)、摄食量(P<0.001，<0.001，0.01，<0.001)均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1、表2)。

表1　各组大鼠体质量的变化±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；造模前～停止造模第1天：n=16；停止造模第6天～停止造模第15天：n=8

表2　各组大鼠摄食量的变化±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；造模第1周～造模第2周：n=16；停止造模第1周～停止造模第2周：n=8

2.2大鼠动情周期

造模期与停止造模期，模型组大鼠动情周期紊乱数量与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.001，<0.001)(表3)。且模型组大鼠阴道涂片显示动情间期持续或延长。

表3　各组大鼠动情周期紊乱数比较[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05；造模期：n=16；停止造模期：n=8

2.3卵巢、子宫系数

停止造模第1天和第15天，模型组大鼠卵巢指数均低于对照组(P=0.01,P<0.001)，差异有统计学意义(P<0.05)；子宫指数(P=0.86,0.69)差异无统计学意义(P>0.05)。停止造模第15天模型组大鼠卵巢指数低于停止造模第1天(P<0.001)，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4　各组大鼠卵巢、子宫指数的变化

注：与对照组比较，*P<0.05；与停止造模第1天模型组比较，#P<0.05

2.4血清激素水平

停止造模第1天和第15天，与对照组比较，模型组大鼠血清E2下降(P<0.001,<0.001)，FSH(P<0.001，0.01)、LH(P=0.02，<0.001)升高，FSH/LH(P=0.01,0.03)升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与停止造模第1天模型组比较，停止造模第15天模型组大鼠E2(P=0.03)下降，FSH/LH(P<0.001)下降，差异有统计学意义(P<0.05)；FSH(P=0.17)、LH(P=0.39)差异无统计学意义(P>0.05)(表5)。

表5　各组大鼠血清激素水平的变化±s)

注：与对照组比较,*P<0.05；与停止造模第1天模型组比较,#P<0.05

3讨论

卵巢早衰的病因目前尚不明确，据报道[3,27-28]，可能与自身免疫功能异常、遗传因素、酶缺乏、促性腺激素及其受体异常、代谢异常、感染因素和损伤因素等有关。POF患者因低雌激素水平、卵巢储备功能下降导致不孕、月经稀发、停经、多汗、烦躁、失眠、抑郁等围绝期症状，严重影响妇女生殖能力和生活质量。早衰在《黄帝内经》中早有记载，《素问·阴阳应象大论》：“帝曰：调此二者奈何？岐伯曰：能知七损八益，则二者可调，不知用此，则早衰之节也。年四十阴气自半也，起居衰也。”《内经》明确提出早衰，并以四十为界，出现升阳之气与降阴之气各半。早衰即未老先衰，《内经》提出的早衰，与现代医学提出的妇女35～40岁出现的停经、卵巢早衰可以相互参照研究，中医学中的妇女早衰就相当于西医的卵巢早衰。《素问·上古天真论》指出 “女子七岁，肾气盛，齿更发长；二七而天癸至……五七，阳明脉衰于上，面皆焦，发始白……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”，阐明了月经的产生与调节以肾为主导，并界定“七”(年)为女性生长变化的周期，“八”(年)为男性生长变化的周期，因此，出现早衰的时间对男性而言，应为五八即40岁左右，对女性而言，应为五七即35岁左右，与现代医学卵巢早衰的主要发病年龄一致。中医“肾主生殖”，《素问·宝命全形论》说：“人身有形，不离阴阳”。肾的功能核心，在于肾阴肾阳之相对平衡协调，病态主要以偏虚为主。肾的阳阳盛衰关系到冲任二脉的通盛与协调，冲任之本在于肾，天癸的至与竭均与肾气的盛衰密切相关。

刘敏如[3]主编的中医妇产科学中新增了卵巢早衰病名，并将脾肾阳虚血瘀证列为第2个证型；在不孕症中，肾阳亏虚证列为首个证型 ；在绝经前后诸症中，肾阳虚证为次于肾气虚、肾阴虚之后的的第3大证型。藤秀香[29]对122名卵巢早衰患者进行证候分析，其中脾肾阳虚证占15.57%。中医古籍中有诸多关于脾肾阳虚、宫寒不孕的记载，如明代薛已《校注妇人良方·求嗣门》比较全面论述了不孕的病因病机，有子宫虚冷的记载：“窃谓妇人之不孕，亦有因六淫七情之邪，有伤冲任，或宿疾淹留，传遗脏腑，或子宫虚冷……”，清代陈士铎在《石室秘录·卷之五·论子嗣》中认为，“女子不能生子有十病。……十病何为？一胞胎冷也，一脾胃寒也……”。《傅青主女科新解·种子·下部冰冷不孕》[30]记载，“夫寒冰之地，不生草木，重阴之渊，不长鱼龙，今胞胎既寒，何能受孕”，指出真火不足，心肾阳虚，胞失温煦，以致宫寒不能摄精而不孕。罗颂平[31]认为，男女生殖方面的疾患，与脏腑、气血、精神、环境、饮食等都有关系，但肾虚是主因，并区别其肾阴虚、肾阳虚、肾阴阳两虚，确诊后对证下药，才可以收到预期效果。由于先天肾气不足，命门火衰，肾阳虚损不能温养子宫，令子宫发育不良；阳虚气血失于温煦，血行滞涩瘀结，导致先后天不足致精血匮乏，冲任亏虚，阴寒内盛于冲任胞宫，则天癸早竭，宫冷不孕，胞宫失养经水早断，引起肾-天癸-冲任-子宫生殖轴失调，发生闭经导致不孕。卵巢早衰与肝、脾、肾虚密切相关，可能通过影响下丘脑-垂体-卵巢轴引起卵巢早衰。随着国家全面实施二孩政策，越来越多35～40岁育龄期妇女有着较强的生育愿意，而不孕症呈高发趋势，其中卵巢早衰是其中一个重要因素，因此研究卵巢早衰对防治不孕症和改善妇女提早出现的围绝期症状、改善生活质量有重要意义。

卵巢分泌的最重要的雌激素是E2，雌激素对卵巢本身的发育是必需的，卵巢生发上皮的功能及卵巢皮质各期卵泡的生长和发育均需要雌激素的存在，颗粒细胞和卵泡膜细胞既是分泌雌激素的部位，其本身也有雌激素受体，并接受雌激素的影响，雌激素可通过下丘脑-垂体前叶，发生正反馈和负反馈作用，间接影响卵巢的形态和功能[32]。卵巢指数也能直接反应卵巢大体功能，卵巢的质量与体积相关，Erdem等[33]研究认为，不孕症卵巢体积、基础窦卵泡数与年龄成反比，卵巢早衰患者的卵巢体积和重量，随着年龄增长而减少，本模型中卵巢重量减少导致卵巢指数降低，说明肾阳虚证大鼠的卵巢重量和形态均发生改变。FSH和LH是垂体分泌的促性腺激素，FSH和LH升高是POF早期指标，基础FSH/LH值能更敏感反映卵巢储备，FSH/LH值升高说明卵巢功能下降[1，34]。POF患者卵巢内分泌的雌激素下降，对垂体的负反馈减弱甚至消失，导致FSH和LH升高。卵巢颗粒细胞还分泌两种抑制素inhibin(抑制素A和抑制素B)，inhibin是卵巢储备功能的主要标志物[35]，对垂体的FSH合成和分泌有反馈抑制作用，Wu等[36]研究表明，inhibin B与FSH、LH以及FSH/LH呈负相关。在POF患者，由于卵巢功能下降，inhibin分泌减少，从而对FSH分泌的抑制减少，导致FSH的升高比LH升高快，是导致FSH/LH值升高的因素。本实验中停止造模第1天和第15天，与对照组比较，模型组大鼠血清E2下降，FSH、LH升高，FSH/LH比值升高，差异有统计学意义。模型组停止造模第15天与停止造模第1天相比，大鼠E2下降，FSH/LH比值下降，差异有统计学意义；FSH、LH差异无统计学意义(P>0.05)。说明第一阶段肾阳虚证卵巢早衰模型造模成功。第二阶段模型持续，可能由于大鼠自我修复能力强，导致FSH/LH比值相对第一阶段下降，但FSH、LH均较模型组及对照组升高，也能说明氢化可的松致SD雌性大鼠肾阳虚证卵巢早衰模型成功。

本实验通过外源性糖皮质激素，使垂体促肾上腺皮质激素释放抑制，使肾上腺皮质分泌类固醇激素减少，使动物出现一系列耗竭现象，造成肾阳虚证动物模型。给药后大鼠出现肾阳虚证表现，外观竖毛、毛无光泽、拱背少动、精神萎靡、嗜睡、蜷缩怕冷、饮食减少、体质量降低、反应迟钝、呼吸深迟，由于肾阳虚影响正常动情周期，动情间期显著延长或动情周期消失，故肉眼未见外生殖器潮湿、阴道口变大、触之兴奋等动情期反应。在停药后第二阶段，大鼠摄食量略增多，体质量缓慢增长。

综上所述，氢化可的松致大鼠肾阳虚卵巢早衰模型大鼠体质量下降，呈明显阳虚证型，动情周期紊乱，动情间期延长或持续，卵巢指数降低，在给药结束后生殖激素异常，且在给药结束后14 d肾阳虚证持续。

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Study on Premature Ovarian Failure Model Induced by Hydrocortisone in SD Rats with Kidney Yang Deficiency Pattern

WangKai1,2,LiuShuaishuai1,GuoQiyue3,LengPing4,JiangFangfei4,SunXiaosheng5△.

1.CollegeofBasicMedicalSciences,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.InstituteofLiuMinru′GynecologicalofTraditionalChineseMedicine,Shenzhen518000,China;3.GuangdongMedicalLaboratoryAnimalCenter,Guangzhou528248,China; 4.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China; 5.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China

【Abstract】ObjectivesTo explore the general situation, ovary index, uterus index, estrous cycle disturbance, and serum reproductive hormone in premature ovarian failure (POF) model induced by hydrocortisone in SD rats with kidney yang deficiency pattern. MethodsSPF sexually matured adult SD rats (8-9 weeks old, not pregnant) were recruited and divided into model and control groups. Hydrocortisone (32 mg/kg per day, for twelve days) was injected in SD rats in model group to construct POF model and SD rats in control group received nothing. After injection, the body weight, ovary index, uterus index, estrous cycle and serum reproductive hormone were compared in two phases (the second and fourteenth days respectively) after the finishing of model construction. Results1) After two phases of injection, the body weight in the model group was lower than that of the control group as well as before injection (P<0.05), there was no significant difference in body weight between the two phases (P>0.05); 2) There was disturbance in estrous cycle in the model group and vaginal smear showed the estrus was maintained or prolonged; 3) The ovary index in the model group was lower than that of the control group as well as before injection (P<0.05), the ovary index in the first phase was lower than that of the second phase (P<0.05). There was no significant difference in uterus index (P>0.05); 4) Compared with the control group and before injection, the concentration of serum E2 decreased, FSH and LH increased, FSH/LH increased, the differences were statistically significant (P<0.05). 5) Compared with the first phase in the model group, the concentration of serum E2 and FSH/LH decreased in the second phase (P<0.05), there was no significant difference in FSH and LH between the two phases in the model group(P>0.05). ConclusionHydrocortisone could cause estrous cycle disturbance, estrus extension, ovary index reduction, reproductive hormone abnormality, and the kidney yang deficiency pattern remained after fourteen days of injection.

【Key words】Hydrocortisone; Kidney yang deficiency pattern; Premature ovarian vailure; Estrous cycle；Model

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.003

*基金项目：广东省教育部产学研结合基金项目(No:2012B091100485)

通信作者：△孙晓生，E-mail：sunxiaosheng@gzucm.edu.cn

【中图分类号】R-332

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160221.2008.012.html

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