菠萝蜜EST-SSR标记开发及其种质资源遗传多样性分析

顾洪涛，李映志，叶春海，陈 亮

(广东海洋大学，广东湛江 524000)

菠萝蜜EST-SSR标记开发及其种质资源遗传多样性分析

顾洪涛，李映志*，叶春海*，陈 亮

(广东海洋大学，广东湛江 524000)

摘要[目的]分析菠萝蜜EST-SSR标记的稳定性和多态性揭示能力，并将其用于菠萝蜜种质资源遗传多样性研究。[方法]利用已获得的菠萝蜜cDNA文库中的EST 序列，通过搜索SSR序列，设计引物，PCR扩增后，银染检测扩增结果。[结果]设计开发出479对EST-SSR引物，其中399对能在菠萝蜜上扩增出产物，282对具有多态性，多态性扩增引物占58.87%；从中选择60对能够清晰扩增的多态性引物，对64份菠萝蜜种质资源进行遗传多样性分析，60对EST-SSR引物共扩增出188条带，不同引物的扩增条带数在2～11，平均3.13条；其中有168条为多态性条带，多态率为89.36%；每对引物的多态信息含量(PIC)为 0.407 7～0.958 9，平均PIC为0.792 2，这说明供试材料具有较高的遗传多样性。系统聚类分析结果表明，在相似系数0.688 1处，可将64份菠萝蜜种质资源分成二大类群，在相似系数0.732 5处，第二大类群又可分为4个亚群。[结论]EST-SSR 标记的多态性揭示能力强，用于分析菠萝蜜种质遗传多态性的能力强，其应用前景广阔。

关键词菠萝蜜；EST-SSR；遗传多样性；种质资源

菠萝蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)，又称木菠萝、树菠萝等，属于桑科菠萝蜜属植物，起源于印度，引入我国已有1400多年的历史[1]，在我国广东、广西、四川、海南和云南等地均有栽培[2]。近年来，随着菠萝蜜经济价值和用途越来越多地被人们所发现和重视，菠萝蜜种植面积不断扩大，对菠萝蜜新品种的需求也日益强烈。分子标记是当前广泛用于农作物新品种选育的重要辅助手段，但在菠萝蜜中可利用的分子标记还很少。

EST(Expressed Sequence Tag)是由cDNA文库克隆、测序获得的序列，属于基因编码区。EST-SSR标记是在EST序列的基础上，通过搜索SSR序列，根据其两侧的序列设计引物开发的一种分子标记。EST-SSR标记的开发避免了SSR开发的高成本、耗力耗时[3]等缺点，却延续了SSR标记的典型优点，即多态性高、重复性好、共显性标记[4]等。由于EST序列来源于基因编码区，与基因功能有关且高度保守，因此，EST-SSR标记可直接鉴定表达重要农艺性状的基因，且在种间具有高度通用性。

近年来，鉴于EST-SSR标记的各种优点，EST-SSR标记被广泛应用于作物种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，如小麦[5]、棉花[6]、辣椒[7]、梨[8]、荔枝[9]、越橘[10]等，但在菠萝蜜中鲜见报道。笔者在测序获得的菠萝蜜EST序列基础上，分析SSR序列特征并用以开发EST-SSR标记，并将其用于菠萝蜜种质遗传多样性分析，以期为进一步开展种质鉴定、基因定位、图谱构建等提供有力工具。

1材料与方法

1.1试验材料从广东海洋大学菠萝蜜种质资源圃随机选取64份菠萝蜜种质，这64份种质主要来自雷州半岛、海南和云南等地，只有小部分来自马来西亚、巴基斯坦等国。采集种质的新鲜叶片，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2方法

1.2.1基因组总DNA提取与检测。液氮磨样后，利用改良的CTAB大量法[11]提取基因组DNA，RNase A消化其中的RNA后，进行精提取，DNA沉淀用1×TE溶解，-20 ℃保存备用。提取的DNA样品使用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和纯度。

1.2.2EST-SSR引物开发。从NCBI中搜索并下载菠萝蜜的EST序列，外加已获得的菠萝蜜EST序列，通过MISA软件搜索SSR序列，再利用Primer 3.0 Plus软件设计SSR引物，委托北京鼎国生物科技有限公司合成。

1.2.3EST-SSR引物扩增与筛选。从64份种质中选取8份形态性状明显差异的种质进行PCR扩增，筛选出能扩增出明显条带的引物。PCR扩增反应体系为20 μL，其中，DNA模板2 μg/mL,dNTPs溶液2 mmol/L，Taq酶50 U/mL，Mg2+溶液2 mmol/L,引物0.2 μmol/L，1×Taq酶Buffer溶液，用去离子水定容至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应产物经6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后，用0.2%的AgNO3染色，含NaOH的甲醛溶液显色。

1.2.4遗传多样性分析。从可扩增出清晰条带的EST-SSR引物中，随机选择60对引物，对收集的64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析。PCR反应体系及扩增程序同“1.2.3”。

1.3数据分析统计EST-SSR标记的带型，有带记为“1”，无带记为“0”，空缺记为“—”。针对每对SSR引物，只读其典型的共显性SSR主带(图1a和1b)；对于不存在共显性2条带型的，即读扩增出来的所有带(图1c)。统计所扩增的条带总数、多态性条带数，并计算多态性条带所占比例和每个引物的多态信息含量(PIC)。利用NTSYSpc-Version 2.02j软件处理“1、0”数据，首先用Similarity程序获得相似系数矩阵，再利用UPGMA法进行聚类分析，获得64份种质的亲缘关系树状图。

2结果与分析

2.1菠萝蜜EST-SSR引物的筛选从菠萝蜜EST序列共设计479对EST-SSR引物，其中有80对引物未扩增出PCR产物，能扩增出产物的引物399对，占83.30%。在能扩增出产物的引物中，有117对引物所扩增出的PCR产物无多态性，多态性引物282对，所占比例为58.87%。这说明由菠萝蜜EST序列开发出的EST-SSR标记在菠萝蜜DNA中有很好的扩增效果。

2.2菠萝蜜EST-SSR标记的多态性从282对多态性引物中选择60对能够扩增出条带清晰、多态性高、易统计的引物，对64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析。扩增结果见图1和表1。60对引物共扩增出188条带，平均每个引物能扩增3.13条带，不同引物扩增的条带数在2～11，其中168条带具有多态性，多态率为89.36%。每对引物的PIC为0.407 7～0.958 9，平均PIC为0.792 2，明显大于0.500 0，这说明EST-SSR在64份菠萝蜜种质上具有较高的遗传多样性揭示能力。

2.3菠萝蜜种质的聚类分析利用NTSYSpc-Version 2.02j软件对64份菠萝蜜种质进行聚类分析，构建其亲缘关系树状图(图2)。由图2可知，60对EST-SSR引物扩增出的168条多态性条带能够将64份菠萝蜜种质资源区分归类，种质之间的遗传相似系数在0.688 1～0.994 7，平均相似系数为0.841 4，这说明64份菠萝蜜种间亲缘关系较近。在相似系数0.688 1处，该64份种质可分为两大组，第一组全部为干苞，第二组既有干苞，又有湿苞(13、25、31和32即为湿苞)。在相似系数0.732 5处，第二组又可分为4个亚组，4个亚组中干、湿苞仍未各自独立聚为一类，这说明干、湿苞不能在DNA水平上完全分开。5和14号、10和11号的相似系数为0.994 7，这说明5和14、10和11号菠萝蜜种质很可能来源于同一亲本或起源于同一地区。

注：a、b、c分别为引物JeSB0001、JeSB0170、JeSB0134，M为DL1 000 DNA Maker，1～64为64份菠萝蜜材料。Note：a，b and c were electrophoresis of JeSB0001，JeSB0170 and JeSB0134，respectively.M was DL1 000 DNA Marker；1-64 were 64 samples of A.heterophyllus.图1　64份菠萝蜜种质EST-SSR标记电泳图谱Fig.1　Electrophoresis of EST-SSR markers in 64 germplasms of A.heterophyllus

序号Code引物名称Primername引物序列(5'-3')Primersequence等位位点数Allelelocus多态性位点PolymorphismlocusPIC1JeSB0001F:TGGCTCCACCTCAATGTATAAAG,R:TGTTACATTTCTTGGAT-GAAGGG210.71482JeSB0006F:AATCAACAGATCTGCTCTTTCCC,R:TGAATGTTGAGGATTAGAAGT-GTGA330.87903JeSB0007F:GTATCGCTATTGAGGTTGTGCC,R:AAGAACAATTCGCCACAGAATTA220.73364JeSB0008F:GTGGGTTTTTGGAATCTTCTTCT,R:TGAAAATCCCAAGACTACTG-GAA330.91175JeSB0020F:GAAATTCTCAAGTCCCGAAAGAG,R:ATTCCATCCGGATTTAGAT-CAAC220.75236JeSB0021F:GTCCAGCAACTGTTGGATAGAAT,R:ATCCCGTAT-GTCTCTCTTTCTCC220.77147JeSB0023F:CTCTGCTTCCACTTCTGCTACTC,R:ATCCCCAAGCCCAATCTC220.75758JeSB0030F:AAATTGACCATTTTCCTCTCTCG,R:CTCTGTTTTTGTCCTCTGTCCTC320.83559JeSB0035F:GAAGATGAAGATCTGAGTTGGGA,R:TGATAAGAGTCCAACCTC-CAAAG220.672410JeSB0049F:CTCTTTGGCTTTCATTTCTTCAA,R:TTGAGGATTCTAAATTGAGCT-GC210.631811JeSB0050F:GCACGGATAACTGTTCAGACTTT,R:AAGCTGAACTTGCTCAGTTTT-GT320.871312JeSB0054F:CGACGGTGAAGAAGAAACAGA,R:CAACAAGAAGCCTTTATTTTCCC210.730213JeSB0057F:AGGAACAGAAACAGCACAGAGAG,R:AAGGACCTGATTGGAATTTT-GAA220.759714JeSB0067F:CCGCTTGAAGAAGTCGAGTAAT,R:AGCTCAGAACTCTCAAAAGCTCA320.601115JeSB0080F:GGTATTCGTACATCTTCTCGTCG,R:ATCACGCTCCCGAAGAAAAAC330.887216JeSB0094F:CCAAATACAATAGAGCAACGACC,R:TGTTGTAGTGTATTGAGC-CATCG220.745817JeSB0095F:CCAAATACAATACAGCAATGCCT,R:AGCCATCGTATGTCAT-CAAAGTT210.745118JeSB0096F:GGCCTAAGCAAAGTGTAACTCAA,R:TGCACTCTACTGCGGATA-AAAAT550.937119JeSB0101F:ATTGGAGATTGGCTCTTTGTCTT,R:TACTCCACGATTGTTTGT-GCTAA330.883120JeSB0102F:CACCTGATTTCATTTCTTCCGTA,R:GTACAGAGCATTCAAC-CCAGAAA210.679421JeSB0104F:GAGGCCAAAGAAGAAGATCAAGT,R:GTAAAGCAATGCTCGAAA-CAAAC550.896722JeSB0106F:GTCCTCCTCTTCTCCTTCTCCTT,R:CGAATCGAGGTCTAATTCTTGG220.745823JeSB0107F:ATAGCCTCCTCTTGAACTTCGAC,R:GTCTGTCAGCATCAACGAGT-TCT430.865724JeSB0108F:TATCAACCCAAATCCTTCCTTTT,R:AGGTCAGTGACGTG-TACGAGTTT430.935025JeSB0111F:CTTCAACAGTGTACTGAGAGCGT,R:CGCTAAAAGAGTCCTTG-GAGAAG320.407726JeSB0116F:TAAAGTCGAAGAAGGAATCTCCC,R:CGAGATACCTTAATCCCTCTC-CT440.933127JeSB0120F:ACCTAACCTCCGAATCTAAACCA,R:AAAAAGCACATAGCCTTAGAC-CC550.958928JeSB0123F:GAGAGAATGGTGCTGATAATTCG,R:CACTATGCTGTAATG-GAAGAGGG320.753329JeSB0125F:GTTAGAGGGAAAACCAAAAGAGC,R:ATATTCTCTTCACGAGAC-CCTCC330.742430JeSB0130F:TCATCTTCATCTTCTTCGTTGGT,R:GAGAGAAAATGGAAAGTGAAG-CA440.907631JeSB0133F:CGACGGCGAGTATAGAAGAGTAA,R:AGATTATTACCACTACCGC-CACC440.880332JeSB0134F:CCCATTTTTGTTCCTTTCTTTTT,R:ACCCTAACTTGGGTTTT-GATTTG11110.955733JeSB0135F:AATTTGCAGTTCGTACAGTGACC,R:TTCGATGATACGAAGGTCGAG440.916634JeSB0137F:AAGGAGATCCCCTGTTGCTC,R:CTTCTTCTAGGTGGCGTATCACC550.948935JeSB0145F:GTTCACAAGTTATTGGTGTGCAA,R:TGAAGGTGAAGATGAT-GATTTTGT330.809536JeSB0149F:TAGGCTTTGTATGAAACCCAAAA,R:TACATCAACCAGTAGCTCCA-CAA220.810437JeSB0150F:GGAGAGGAGAGGTCAGTTCTAGC,R:AGCGCTCTAAGAATTCTG-GTTTT330.654538JeSB0155F:ACTGCCTTAGAGAGGGAAAGAGA,R:TACACGCGTTTTACAGCTAAA-CA540.953439JeSB0161F:GAAACATAGGAGACCCACATGAA,R:ATAATGGTATCTCGGAGG-GAAAA220.757340JeSB0165F:ATGTTGAATATAATGGGCACCAG,R:AATGCAACAACAAAGTCAG-GATT310.499841JeSB0166F:GAGAAGGAGGAAGAGGATGAAGA,R:TTCGGATGTAATATGCATA-AGCTC220.779342JeSB0170F:TAGGGCATGAGTTTGACCACTAT,R:ACACCCCTTTTCTTCT-CAAAATC660.955743JeSB0171F:AGTGAGGAGGAGAAGGAGAAAGA,R:AAAAACCACACATCAT-CAAAAGC330.719544JeSB0174F:GAAGGACAATGATGACGAGAATC,R:TGACCCATTTGAGAAT-TCATCTT210.749545JeSB0179F:TCCCTGATCATCAAGTTTTTCTT,R:GCAGGAATTCCCTTCTTTTTA-AC220.764846JeSB0181F:CTGAGCTACAACCACAGCCA,R:CATCAACGACGAACACGAAC440.936447JeSB0185F:AAAACGTTACGCAACTACTGCTG,R:GTAGTGTTGGGGTGTGTCT-TAGC220.717048JeSB0187F:CTCAAGCTTCCCTTCTTCCTTC,R:TCTCGAGGTAGAGGATCTTTTCA430.882949JeSB0190F:GCATACAACGACCAGTTTCATAA,R:GCTCTTGTTGTTCTTAAGGTT-GAA220.608250JeSB0206F:CGAATAAGACCCATACTCATCT,R:AAAGAATTGAACAAGG-GAGAAGG330.733151JeSB0224F:AAGCTTGACCTCATCAATGTAGC,R:CTACATCCACACCTACGCTCTCT210.749852JeSB0233F:CGCAAAGAATCTGATAGAACAGC,R:GATTGACCCCTAAGAAAG-CAACT220.735253JeSB0235F:AAACTCAGAAGCTGTTTCAGGTG,R:AGACATGGACACCTCTGGT-GAAT210.749054JeSB0241F:GGTTTCTGAAATTGTGTTTCCTG,R:TTTTCTCCAAATTAGGGCTA-AGG880.984855JeSB0268F:TGAACTCAACTCTCCCTCTTCAC,R:ACCATCTTCATCATCACCATCAT330.895156JeSB0284F:AGCGTTTCAATGGTTTTAGCAG,R:GTCCTCTTTAACGACGCCTTTT220.545757JeSB0291F:GTCAGGAAATTGAAGCATTTTGG,R:CTGTTTATAATAGCTC-CCGGGTC320.876458JeSB0320F:CAGCAGCAACAGCAAACTAATC,R:TCTGGTTCTGTAAATTGAACTGC220.702959JeSB0326F:GTTGGAATTGCTAACAGTGTAGA,R:GTCTGCATCTCTCGCTTCCT330.894460JeSB0447F:CTTGCCCTTTTTCACTGTTTATG,R:TTTTGATTCTTGTGCAGTTGC-TA220.7186总计Total1881680.7922

注：13、25、31和32号为湿苞，其余均为干苞。Note:13, 25, 31 and 32 wer wet buds; others were dry buds.图2　64份菠萝蜜种质资源聚类图Fig.2　UPGMA dendrogram of the 64 germplasms of A.heterophyllus

3讨论

虽然分子标记技术较为成熟，并被广泛应用于作物种质资源遗传多样性分析、基因组比较、遗传图谱构建、基因组关联分析及QTL定位等，但在菠萝蜜遗传分析中的应用较少，主要是AFLP、ISSR、RAPD等。王艳红[12]利用磁珠法发掘菠萝蜜SSR分子标记，但效率偏低。EST-SSR标记由cDNA文库中的EST序列设计而来，开发成本低，在种质资源遗传分析方面具有独特的优越性，而且其呈现的是基因编码区变异，是功能基因的直接鉴定与评价。

在该研究中，由菠萝蜜EST序列设计出的479对SET-SSR引物中，能有效扩增出PCR产物的引物有399对，有效扩增率为83.30%，其中能产生多态性扩增产物的引物有282对，多态性扩增率为58.87%，高于董清华等[13]开发的草莓EST-SSR标记的多态性扩增率53.00%，显著高于Eujayl等[14]开发的小麦EST-SSR标记的多态性扩增率16.00%。这表明由菠萝蜜EST序列开发SSR标记具有较高的效率。

从多态性扩增引物中选择清晰易读的EST-SSR引物60对，对64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析。结果表明，60对引物共扩增出188条带，其中具有多态性的条带数为168，占89.36%，显著高于Li等[15]利用AFLP对50份菠萝蜜种质分析的20.3%，高于叶春海等[16]利用RAPD对雷州半岛菠萝蜜种质分析的88.4%。每对引物的PIC在0.407 7～0.958 9，平均PIC为0.792 2，明显大于0.500 0，这表明EST-SSR标记应用于菠萝蜜研究不仅可行，还具有较高的多态性揭示能力。

该研究聚类结果仍未能将菠萝蜜干、湿苞分开，这与王耀辉[17]的研究结果一致。但聚类分析所获得的遗传相似系数在0.688 1～0.994 7，平均相似系数为0.841 4，高于王耀辉[17]利用ISSR标记分析78份菠萝蜜种质的相似系数0.502 3～0.944 7和平均相似系数0.766 6，还高于王艳红[12]对菠萝蜜种质聚类分析的相似系数0.576 3～0.965 5和平均相似系数0.814 0。这可能是因为64份菠萝蜜种质资源亲缘关系较近，但也不能排除是因为EST-SSR标记来源于cDNA文库所致。cDNA文库中的序列来自高度保守的基因编码区，正因高度保守，在植物进化过程中，发生突变的概率相对较小，基因间差异也较小。

4结论

菠萝蜜的EST-SSR 标记是一种高效的功能性标记，其引物开发设计过程简单、省时省力，PCR扩增条带清晰、效果稳定，适用于菠萝蜜种质资源之间的遗传多样性分析。该研究由EST设计开发的60对EST-SSR引物不仅能扩增出清晰的条带，且64份种质的遗传多样性聚类分析结果体现出较高的多态性揭示能力。因此，随着EST数据库中EST序列的丰富，EST-SSR标记被越来越多地应用于菠萝蜜种质资源研究，为促进菠萝蜜种质资源的创新利用和遗传改良奠定基础。

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Development of EST-SSR Markers inArtocarpusheterophyllusLam. and Its Genetic Diversity Analysis of Germplasm Resources

GU Hong-tao, LI Ying-zhi*, YE Chun-hai*et al

(Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524000)

Abstract[Objective] To analyze the stability and polymorphism reveal ability of EST-SSR markers in Artocarpus heterophyllus Lam., and to apply in genetic diversity analysis of germplasm resources. [Method] By using the obtained EST sequence in A. heterophyllus cDNA library, SSR sequences were searched, and primer was designed. After PCR amplification, the amplified results were detected by silver staining method. [Result] A total of 479 pairs of EST-SSR primers were designed. Among them, 399 pairs could amplify products in A. heterophyllus DNA, and 282 pairs had polymorphic bands, accounting for 58.87%. Then, 60 pairs of polymorphic primers were selected to analyze genetic diversity among 64 germplasms of A. heterophyllus. Sixty pairs of EST-SSR primers produced 188 bands; and the amplified bands per pair of primers ranged from 2 to 11 with an average of 3.13. Among them, there were 168 polymorphic bands, showing a polymorphic rate of 89.36%. Polymorphic information content (PIC) of each pair primers was 0.407 7 - 0.958 9 with an average PIC of 0.792 2, indicating that the test material had a higher genetic diversity. Cluster analysis showed that 64 A. heterophyllus germplasms were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.688 1. The larger group was then divided into four subgroups at the similarity coefficient of 0.732 5. [Conclusion] EST-SSR markers of A. heterophyllus has strong polymorphism reveal ability, and can be used to identify genetic differences among different A. heterophyllus germplasms, showing broad prospects in application.

Key wordsArtocarpus heterophyllus Lam.; EST-SSR; Genetic diversity; Germplasm

基金项目广东省科技计划项目(2013B020304004)。

作者简介顾洪涛(1990- )，女，湖北黄岗人，硕士研究生，研究方向：园艺作物遗传育种。* 通讯作者，李映志，教授，博士，硕士生导师，从事园艺作物遗传育种研究；*通讯作者，叶春海，教授，博士，博士生导师，从事园艺作物遗传育种研究。

收稿日期2016-03-30

中图分类号S 602

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-135-05