非甾体类抗炎药阿司匹林、吲哚美辛对胃癌MGC803细胞的抑制作用研究

唐　菁，曲丽梅，曹维斌，李笃军△

(山东省烟台业达医院：1.检验科；2.血液肿瘤科，山东烟台 264006)

·论著·

非甾体类抗炎药阿司匹林、吲哚美辛对胃癌MGC803细胞的抑制作用研究

唐菁1，曲丽梅1，曹维斌2，李笃军1△

(山东省烟台业达医院：1.检验科；2.血液肿瘤科，山东烟台 264006)

摘要:目的探讨非甾体类抗炎药阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)促进胃癌MGC803细胞凋亡、抑制增殖的作用和机制。方法细胞增殖检测(MTT)法检测ASP、Indo对MGC803细胞增殖的影响；流式细胞技术检测ASP、Indo对MGC803细胞凋亡的影响；细胞免疫化学方法检测ASP、Indo对MGC803细胞表达C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。结果与对照组相比，ASP、Indo对MGC803细胞具有明显的增殖抑制作用及促进MGC803细胞凋亡的作用；MGC803细胞高表达CRP、IL-6，ASP、Indo能下调MGC803细胞CRP、IL-6的表达水平。结论非甾体类抗炎药ASP、Indo对胃癌MGC803细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，并能下调MGC803细胞中CRP、IL-6的表达。

关键词:阿司匹林；吲哚美辛；肿瘤细胞增殖；CRP；IL-6

多年来，在应用手术、放化疗及生物治疗等方法治疗肿瘤的同时，科学研究也在不断地开发新的抗肿瘤药物。阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)是常用的非甾体类抗炎药(NSAIDs)，流行病学研究发现，长期规律的服用NSAIDs可以明显降低肿瘤的发生及延缓肿瘤的发展[1-2]。并且，研究发现，NSAIDs的抑癌机制可以分为环氧化酶-2(COX-2)依赖型和非环氧化酶-2依赖型[3]。C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)作为炎性细胞因子，可通过自分泌、旁分泌或相关联动效应来促进肿瘤生长及转移[4-5]。本研究通过观察ASP、Indo对胃癌细胞株MGC803增殖、凋亡的影响，同时检测CRP、IL-6的表达变化，为临床应用NSAIDs在胃癌方面的治疗提供理论和实验依据。

1资料与方法

1.1细胞株与主要试剂人胃癌细胞株MGC803由滨州医学院中心实验室提供。ASP、Indo购自上海如吉生物科技发展有限公司产品。细胞培养基(DMEM)、胰蛋白酶为Gibco公司产品，青霉素、链霉素购自山东鲁抗制药公司。MTT系Promega公司产品。PI试剂盒购自美国Sigma公司产品，Rabbit Anti-CRP单克隆抗体及Rabbit Anti-IL-6单克隆抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司。DAB显色试剂盒系北京中衫金桥生物技术有限公司产品。

1.2MTT法检测ASP、Indo对MGC803细胞增殖的影响[6]取对数生长期的MGC803细胞(5×104/mL)，接种于96孔板，37 ℃、5%CO2孵箱孵育过夜后，实验组细胞分别加入不同浓度的ASP、Indo，作用终质量浓度分别为ASP 2、4、8、10 mmol/L；Indo 200、400、800、1 000 μmol/L；对照组加10%小牛血清DMEM培养液，继续培养48 h，终止培养前4 h加入MTT(5 mg/mL)，4 h后置酶标仪下测定光密度(OD)值，以570 nm为检测波长，630 nm为参考波长，以570～630 nm计算OD值。

1.3PI染色流式细胞术检测MGC803细胞凋亡[7]取对数生长期的MGC803细胞(5×104/mL)，实验设空白对照组、8 mmol/L ASP组、800 μmol/L Indo组共3个组别，每组各6瓶细胞，孵箱内细胞培育48 h后终止培养，以0.25%的胰酶消化后，每组分别制成单细胞悬液，各收集细胞数目约(1～5)×106个，500～1 000 r/min离心5 min，弃去培养液；3 mL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，离心去PBS；加入冰预冷的70%乙醇固定，4 ℃，过夜；离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min；400目的筛网过滤1次，500～1 000 r/min离心5 min，弃去PBS；用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min；流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图，也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

1.4免疫细胞化学检测MGC803细胞中CRP、IL-6表达变化[8]取对数生长期的MGC803细胞(1×105/mL)，接种于放有盖玻片的24孔培养板，2 mL/孔，实验设空白对照组、8 mmol/L ASP组、800 μmol/L Indo组共3个组别，每组设3个复孔，孵箱内细胞培育48 h后终止培养。取出细胞玻片，PBS洗5 min，洗3次，4%多聚甲醛固定，4 ℃，过夜，蒸馏水洗5 min，洗3次，按文献[9]灭活内源性过氧化物酶和免疫细胞化学染色，用Leica DM 4000B显微镜拍照，并通过Leica QwinV3分析软件进行染色结果的灰度值扫描分析，蛋白表达强弱与灰度值成反比。

1.5统计学处理采用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，分析方法包括t检验、χ2检验和Pearson线性相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1ASP、Indo对MGC803细胞增殖的影响结果显示，不同浓度的ASP、Indo作用于MGC803细胞48 h后，对MGC803细胞具有增殖抑制作用，其中ASP 4、8、10 mmol/L,Indo 400、800、1 000 μmol/L组与未用药对照组相比增殖抑制作用明显，且差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2ASP、Indo对MGC803细胞凋亡的影响流式细胞仪分析结果显示，MGC803细胞经8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用药48 h后均出现了明显的凋亡，各实验组的凋亡率分别为(31.9±3.21)%和(29.0±3.01)%，与对照组的(9.3±0.45)%比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A:ASP 对MGC803细胞增殖的影响;B:Indo对MGC803细胞增殖的影响。

图1ASP、Indo对MGC803细胞增殖的影响

2.3ASP、Indo处理后MGC803细胞中CRP、IL-6的表达变化免疫细胞化学染色结果显示，在两组图的对照组细胞胞质中可见大量的棕黄色颗粒，提示CRP、IL-6蛋白在MGC803细胞中表达为强阳性。MGC803细胞经8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用药48 h后，与未用药对照组相比，细胞质褐色的CRP、IL-6蛋白的表达明显下降，并且病理图像分析结果显示，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo药物处理后CRP表达灰度值分别为179±8.5、190±7.6；IL-6表达灰度值分别为165±2.4、184±3.4，均高于各自对照组的86±4.3和95±5.0，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

A:流式细胞术分析对照组MGC803细胞凋亡;B:流式细胞术分析8 mmol/L ASP诱导的MGC803细胞凋亡C:流式细胞术分析800 μmol/L Indo诱导的MGC803细胞凋亡。

图2ASP、Indo对MGC803细胞凋亡的影响

A:免疫细胞化学分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的CRP的表达B:免疫细胞化学分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的IL-6的表达。

图3ASP、Indo处理后MGC803细胞中CRP、IL-6的表达变化

3讨论

癌症尽管在早期诊断和防治方面取得很大成绩，但目前仍是人类亟待解决的难题之一。近年的流行病学、临床和实验研究证实，长期服用临床常用于解热、镇痛、抗炎的NSAIDs如ASP、Indo等，与多种肿瘤的发生呈负相关，可以显著降低乳腺、肺、前列腺、膀胱、卵巢、食道和胃及部位肿瘤发病率[3]。Waddell等[9]于1983年最早报道了NSAIDs与肿瘤的发生具有量效关系，长期服用NSAIDs可以明显减少家族性腺瘤样息肉(FAP)患者的息肉数量。并且后来的随机临床试验也证实了每天服用剂量300～400 mg的苏灵大(苏灵大属于NSAIDs，结构同吲哚美辛)4～6个月，可以降低FAP患者腺瘤数量的70%[10]。

除临床研究以外，还有大量的实验动物模型和体外的试验研究证明NSAIDs具有明显抑癌作用。Pollard等[11]报道，Indo在致癌物质诱导的结肠癌动物模型中具有一定的抑癌活性。随后的试验研究也证实了不同种类的NSAIDs对结肠癌的不同程度的抑癌作用[12]。孙振华[13]在体外试验中发现，ASP能够抑制原癌基因ErbB2的表达，进而抑制其下游细胞生存相关的信号通路，从而诱导了宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡。Li等[14]研究发现，ASP能够通过抑制Mcl-1的表达来增强细胞凋亡调节蛋白Bcl-2高亲和力靶向抑制剂ABT-263介导的抗肿瘤作用，从而对肝癌细胞起到诱导凋亡的作用。孙振海[7]研究结果显示，NSAIDs塞来布昔可以通过抑制结肠癌细胞SW480中BiP蛋白的表达，从而起到促进肿瘤细胞凋亡的作用。董兆如[15]的研究显示，低浓度ASP(1 mmol/L)联合干扰素α(IFN-α)较单独作用于肝癌细胞时，凋亡数量明显增加，提示低浓度ASP协同IFN-α诱导肝癌细胞凋亡有较好的效果。本课题以胃癌细胞株MGC803细胞为靶细胞，将4、8、10 mmol/L ASP与400、800、1 000 μmol/L Indo作用于MGC803细胞48 h后，发现其对MGC803细胞具有明显的增殖抑制作用。并且研究还发现，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用药48 h后，细胞凋亡明显增加。

IL-6原称B细胞刺激因子2、B细胞分化因子、IFN-β2、杂交瘤/浆细胞瘤生长因子、26×103蛋白、肝细胞刺激因子等。产生IL-6的细胞主要有单核/巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞及T细胞(主要是Th2)等，此外还包括骨髓瘤细胞株、宫颈癌细胞株等。IL-6的生物学活性，除了在细胞因子网络中可发挥多种效应，如免疫调节、刺激造血、防御作用、急性期反应等外，还具有促进肿瘤生长的作用。如IL-6合成增加与多发性骨髓瘤的发生有关，IL-6在体外可促进浆细胞瘤和骨髓瘤细胞的生长。某些肿瘤可高表达IL-6，使细胞增殖失控，对肿瘤的发生和发展起重要作用[16]。研究证明，部分肺癌细胞系可以产生IL-6，作为自分泌、旁分泌的生长因子，促进肿瘤生长及向周围组织侵袭。并且白血病、肾癌、骨髓瘤等多种肿瘤细胞生长也均依赖于IL-6的自分泌能力[5,17]。CRP是一种急性时相反应蛋白，作为炎症和急性组织损伤的非特异标志物广泛应用于临床。近几年临床研究显示，许多胃肠、肝胆、胰腺癌患者的血清CRP水平会升高[18]。并有研究显示，CRP联合CEA、CA724对胃癌的早期诊断和病情判断也有一定的临床应用价值，但CRP在胃癌细胞中的表达水平及作用机制还有待进一步研究[19]。因此，本实验将CRP、IL-6作为研究的靶因子，免疫细胞化学发现CRP、IL-6在胃癌MGC803细胞中呈高表达状态，并且与空白对照组相比，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用药48 h后， MGC803细胞中CRP、IL-6的表达明显下降，说明 ASP、Indo对胃癌MGC803细胞的增殖抑制、诱导凋亡的作用机制可能与其抑制细胞中CRP、IL-6的产生有关。

先前针对NSAIDs的抑癌机制大都集中于其能抑制具有诱导炎症反应和致癌变作用的COX-2的表达有关，本课题将具有促进肿瘤细胞生长的CRP、IL-6作为研究靶分子，发现NSAIDs ASP、Indo抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡的可能作用机制与其抑制细胞中CRP、IL-6的产生有关，从而为临床应用NSAIDS的抗癌治疗提供了一定试验基础。

参考文献

[1]Thun MJ,Henley SJ,Patrono C.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs as anticancer agents:Mechanistic,pharmacologic,and clinical issues[J].J Natl Cancer Inst,2002,94(4):252-266.

[2]Ruder EH,Laiyemo AO,Graubard BI,et al.Non-steroidal anti-inflammatory drugs and colorectal cnacer risk in a large,prospective cohort[J].Am J Gastroenterol,2011,106(7):1340-1350.

[3]Gurpinar E,Grizzle WE,Piazza GA.NSAIDs inhibit tumorigenesis,but how?[J].Clin Cancer Res,2014,20(5):1104-1113.

[4]Mckeown DJ,Brown DJF,Kelly A,et al.The relationship between circulating concentrations of C-reactive protein,inflammatory cytokines and cytokine receptors in patients with non-small-cell lung cancer[J].Br J Cancer,2004,91(12):1993-1995.

[5]Takenawa J,kaneko Y,Fukumoto M,et al.Enhanced expression of interleukin-6 in primary human renal cell carcinomas[J].J Natl Cancer Inst,1991,83(2):1668-1672.

[6]Kan SH,Jing T,Li DJ,et al.Inhibition of the expression of a proliferation-induced ligand APRIL in HepG2 cell line and the revesal on tumor immune evasion by Chinese medicine[J].Bangladesh J Pharmacol,2012,7:236-242.

[7]孙振海，杜寒松，龙跃平，等．奥曲肽联合NSAIDs对结肠癌细胞生长的影响及作用机制[J]．华中科技大学学报:医学版，2012，41(3)：306-309．

[8]周任，张龙洲，王睿智．塞来昔布对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡和Survivin表达的影响[J]．癌症，2010，29(3)：316-322．

[9]Waddell WR,LoughryRW.Sulindac for polyposis of the colon[J].J Surg Oncol,1983,24(1):83-87.

[10]Keller JJ,Giardiello FM.Chemoprevention strategies using NSAIDs and COX-2 inhibitors[J].Cancer Biol Ther,2003,2(4 Suppl 1):S140-149.

[11]Pollard M,Luckert PH.Indomethacin treatment of rats with dimethylhydrazine-induced intestinal tumors[J].Cancer Treat Rep,1980,64(12):1323-1327.

[12]Kawamori T,Rao CV,Seibert K,et al.Chemopreventive activity of celecoxib,a specific cyclooxygenase-2 inhibitor,against colon carcinogenesis[J].Cancer Res,1998,58(3):409-412.

[13]孙振华．阿司匹林抑制ErbB2诱导宫颈癌细胞凋亡[D]．长沙：湖南师范大学，2009．

[14]Li GQ,Zhang SJ,Fang HB,et al.Aspirin overcomes Navitoclax-resistance in hepatocellular carcinoma cells through suppression of Mcl-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,434(4):809-814.

[15]董兆如．小剂量阿司匹林协同干扰素-α诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的实验研究[D]．济南：山东大学，2012．

[16]龚非力.基础免疫学[M].武汉：湖北科学技术出版社,1998.

[17]姜正华．白介素-6与肺癌[J]．国际呼吸杂志，1997，17(3)：148-150．

[18]Miyake K,Imura S,Nishioka M,et al.Serum evaluation of soluble interferon-alpha/beta receptor and high-sensitivity C-reactive protein for diagnosis of the patients with gastrointestinal and hepatobiliary-pancreatic cancer[J].Cytokine,2010,49(3):251-255.

[19]唐菁，陈海霞，李笃军．CRP联合CEA、CA724检测对胃癌早期诊断及病情判断的临床应用价值[J]．重庆医学，2013，42(1)：63-65．

Experimental study of the inhibition mechanism of ASP and Indo on human gastric carcinoma cell line MGC803

TangJing1,QuLimei1,CaoWeibin2,LiDujun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofHematology,YantaiYedaHospital，Yantai,Shandong264006，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of ASP and Indo inducing the apoptosis and inhibiting the proliferation of human gastric carcinoma MGC803 cell in vitro and its mechanism.MethodsInhibition rate was tested by MTT method;apoptosis induced by ASP and Indo in MGC803 cells was investigated by applying flow cytometry analysis techniques;the expression of CRP and IL-6 was analyzed by immunocytochemistry(ICC) analysis.ResultsCompared with the control,ASP and Indo significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis of MGC803 cells;CRP and IL-6 were strongly expressed on MGC803 cells,and ASP and Indo down-regulated the expression levels of CRP and IL-6.ConclusionNSAIDs ASP and Indo can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of MGC803 cells,and can down-regulating the expression of CRP and IL-6.

Key words:ASP;Indo;tumor cell proliferation;CRP;IL-6

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.016

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)10-1341-03

(收稿日期：2015-12-01)

作者简介：柴晓文，男，副主任技师，主要从事临床免疫方向的研究。