葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响

张　萌，边志刚，何　平*

葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响

张萌a，边志刚b，何平a*

中国医科大学附属盛京医院a.干诊科，b.鼻科，沈阳 110004

[摘要]目的探讨葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响及其作用的分子机制。方法体外培养BGC-823细胞，MTT法观察葫芦素B对细胞增殖的影响，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，采用分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9的活性，采用Western blot方法检测葫芦素B对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果葫芦素B对BGC-823细胞的增殖有抑制作用，且此作用呈剂量和时间依赖性；流式细胞仪检测结果显示，葫芦素B诱导BGC-823细胞凋亡，呈剂量依赖性。葫芦素B处理后Caspase-3、Caspase-9活性升高，细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bak的表达增加。结论葫芦素B可以抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖并诱导细胞凋亡。

[关键词]葫芦素B；胃癌；凋亡

0引言

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，据报道，2008年全球胃癌患者的5年生存率约为20%[1]，2010年胃癌成为全球第2大肿瘤致死因素[2]，严重威胁人类健康。由于胃癌早期的临床症状不明显，约2/3的患者就诊时已为局部晚期或伴有转移，丧失了手术治疗的时机，化疗成为主要的治疗手段。目前用于治疗胃癌的化疗药物种类很多，但联合化疗方案并没有显著提高治疗有效率，没有达到使患者总生存获益的目的，而化疗药物本身的毒副作用明显，使患者难以耐受。因此，探索新的治疗药物对胃癌的治疗具有重要意义。

葫芦素是从葫芦科植物甜瓜蒂及其他科属多种植物中提取到的一类具有苦味或甜味的四环三萜类化合物,具有抗炎、保肝、提高机体免疫力及抗肿瘤等多种生物活性[3-4]。葫芦素B(Cucurbitacin B，CuB)是其中含量最为丰富的一类，目前对其研究也很多。葫芦素B具有多种生物活性，目前主要用于慢性肝炎和肝癌的治疗[5-8]。近年的研究报道显示，低浓度的葫芦素B可以对多种肿瘤细胞起到抑制作用，如白血病、肺癌、结肠癌、乳腺癌和神经母细胞瘤等[9-14]，而且葫芦素B在不同肿瘤细胞中的作用机制并不完全相同。有关葫芦素B对胃癌的作用及其内在机制的研究，国内外尚未见报道。本试验通过检测葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响，从分子水平上研究葫芦素B对胃癌细胞的影响及内在机制，为胃癌的治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料与试剂人胃癌BGC-823细胞购自中科院上海细胞所；葫芦素B购自中国药品生物制品检定所；胎牛血清购自天津灏洋生物公司；RPMI 1640培养基购自GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒及Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Annexin V/PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；β-actin、Bcl-2和Bax抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自武汉博士德生物工程公司；增强化学发光试剂盒购自Thermo Scientific Pierce公司。

1.2细胞培养人胃癌BGC-823细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中无菌培养，每2～3天传代1次，镜下观察细胞贴壁达80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化传代。选取对数生长期细胞进行实验。

1.3MTT 法检测细胞增殖将消化收集好的BGC-823细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整成浓度为1×105/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL。细胞贴壁后，分别加入含不同浓度葫芦素B的培养液，使其终浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μmol/L，每组设3个复孔，同时设空白对照组以及阴性对照组。继续培养24、48和72 h后，每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，小心吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡至结晶溶解后，酶标仪(波长570 nm)检测每孔光密度值(OD值)。增殖抑制率按如下公式计算：抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡将人胃癌BGC-823细胞接种于6孔细胞培养板，每孔5×105个，待细胞贴壁后，分别加入含0.1、0.5 μmol/L葫芦素B的培养液，并设空白对照组，继续培养24 h。0.25%胰酶消化后收集细胞，4 ℃、1 500 r/min离心5 min收集细胞，预冷磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)离心洗涤细胞2次。加入500 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，各加入10 μL Annexin V-FITC及5 μL PI，进行双染色，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，上机检测。Cellquest专业软件获取分析数据。实验重复3次。

1.5检测Caspase-3、Caspase-9活性将对数生长期的细胞接种到75 cm2培养瓶中，细胞生长24 h后加入0.1 μmol/L的葫芦素B溶液，并设空白对照组(加等量RPMI-1640培养基)，培养24 h后以0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次(2 000 γ/min离心5 min)，收集3×105个细胞，加入50 μL冰冷Caspase Lysis Buffer，使用前每50 μL裂解液加入0.5 μL二硫苏糖醇(Dithiothreito，DTT)，冰浴裂解，提取蛋白。Bradford法测定蛋白浓度。吸取50 μL含200 μg蛋白的细胞裂解上清(各组均采用相同的蛋白量进行测定和比较，如体积不足50 μL，用PBS补充总体积至50 μL)，加入50 μL 2×Reaction Buffer，使用前每50 μL 2×Reaction Buffer加入0.5 μL DTT。加入5 μL Caspase-3或Caspase-9 substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶标仪值(λ=405 nm)测定OD值，通过计算实验组OD值/对照组OD值来检测Caspase-3/-9的活化程度。以50 μL Lysis Buffer+50 μL 2×Reaetion Buffer作为空白对照。实验重复3次。

1.6Western blot检测Bcl-2和Bax的表达将BGC-823细胞接种于75 cm2培养瓶中，生长24 h后加入含0.1、0.5 μmol/L葫芦素B的培养液继续培养24 h。加等量RPMI-1640培养基作为阴性对照。冰浴裂解细胞，提取细胞蛋白，测定并调整蛋白浓度。灌制分离胶为12%、浓缩胶为5%的SDS-PAGE凝胶。样品与2倍浓度的上样缓冲液以体积比1∶1混合，40 μg/孔上样，90 V电泳至浓缩胶分离胶界面，再120 V电泳至凝胶底部。湿法电转恒压100 V，120 min，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。5%脱脂奶粉(含0.1% Tween 20)室温封闭1 h，洗膜后加入1∶500稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶结合的相应二抗，常温孵育1 h。增强化学发光显影，UVI凝胶成像系统检测蛋白表达情况。

2结果

2.1葫芦素B抑制BGC-823细胞的增殖MTT法检测结果显示，不同浓度的葫芦素B对BGC-823细胞均有增殖抑制作用。增殖抑制作用随着药物浓度的增大及作用时间的延长而增强，表明葫芦素B对BGC-823细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析，P<0.05。经LSD-t检验，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间均有显著性差异(P<0.05)，见图1。

图1　葫芦素B对BGC-823细胞的增殖抑制作用(MTT法)

2.2葫芦素B对BGC-823细胞凋亡的影响用0.1、0.5 μmol/L的葫芦素B作用于BGC-823细胞24 h后，收集细胞，采用Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况。见图2。结果表明，BGC-823细胞凋亡率随着葫芦素B给药浓度的增加而增加。与对照组相比，0.1、0.5 μmol/L的葫芦素B诱导的细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2　流式细胞术检测葫芦素B对BGC-823细胞凋亡的影响

图3　0.1、0.5 μmol/L葫芦素B对BGC-823细胞凋亡的影响

2.3葫芦素B对BGC-823细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响0.1 μmol/L葫芦素B处理BGC-823细胞24 h后，Caspase-3和Caspase-9被活化，从而参与细胞凋亡的发生，见图4。

2.4葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞Bcl-2、Bak蛋白表达水平的影响Western blot检测结果显示，0.1、0.5 μmol/L的葫芦素B作用于BGC-823细胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达逐渐下降，促凋亡蛋白Bak表达升高，随葫芦素B作用浓度的增加，这种趋势更加明显，见图5。

3讨论

目前，临床常用的胃癌化疗药物有氟尿嘧啶、铂类及紫衫醇类，药物的毒副反应均相当严重，而患者的平均生存期未明显提高，因此，寻找高效、低毒的胃癌治疗药物尤为重要。近年来，随着中药抗肿瘤作用的实验和临床研究的深入开展，中药复方及天然单体成分在肿瘤治疗中的地位日趋受到重视，越来越多的中药复方及单体成分逐渐应用于临床化疗及辅助化疗[15-16]。已有多项研究表明，葫芦素B可以体外抑制多种肿瘤细胞的增殖[9-14]，同时对化疗亦有增敏作用。

图4　葫芦素B对BGC-823细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响

细胞凋亡是由基因调控的细胞的程序性死亡，在生物的发育和进化中起着至关重要的作用。一般认为，肿瘤的发生不仅是细胞异常增殖和分化的结果，也与细胞凋亡的异常有关，是细胞的凋亡机制受到抑制，机体不能及时清除体内过多的、受损伤的或恶变的细胞的结果。诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤药物治疗的主要目标。

图5　葫芦素B对BGC-823细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

细胞凋亡的机制非常复杂，一般分为外源性途径和内源性途径。内源性细胞凋亡途径始于线粒体内细胞色素C的释放[17]，Caspase级联反应和Bcl-2家族蛋白的调控等都是影响细胞发生内源性凋亡的重要机制[18]。Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中，是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，它们引发的级联反应是细胞凋亡信号转导过程中的中心环节，并可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡。大量资料显示，在许多肿瘤细胞凋亡的过程中有Caspase的活化。细胞接收到凋亡信号后，细胞色素C从线粒体释放到胞浆中，激活下游的Caspase-9，进而使Caspase蛋白酶发生酶解级联激活，包括Caspase-2、3、6、7、8、10等。其中Caspase-3是最重要的凋亡效应因子，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用，与染色体聚集、DNA断裂及凋亡小体的形成有关，可能是凋亡事件的真正执行者[19-20]。Bcl-2家族蛋白通过维持线粒体膜的稳定性来影响细胞内源性凋亡，其中Bcl-2蛋白起到维持线粒体膜稳定性的作用，控制着细胞色素C等物质的释放，以起到抗凋亡的作用，Bax蛋白可通过破坏线粒体膜的稳定性，以达到促凋亡的作用，Bcl-2/Bax蛋白通过同源和异源二聚体来共同调节线粒体膜的稳定性，是细胞凋亡的最有效指标之一[21]。

本研究结果显示，葫芦素B可以显著抑制胃腺癌细胞BGC-823的增殖，增殖抑制效应呈剂量和时间依赖性。Annexin V/PI双染流式细胞仪检测结果显示，0.1、0.5 μmol/L的葫芦素B可使BGC-823细胞发生凋亡，且作用呈剂量依赖性。Caspase-3、Caspase-9活性检测表明，葫芦素B处理使BGC-823细胞内的Caspase-3和Caspase-9被活化。Western blot结果显示，与对照组相比，葫芦素B处理组细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下调明显，与此同时促凋亡蛋白Bax上调。上述结果提示，葫芦素B促BGC-823细胞凋亡的机制可能是因为下调抗凋亡蛋白Bcl-2、上调促凋亡蛋白Bax，并最终破坏了线粒体膜完整性，进而激活Caspase-3来促发的，为进一步研究葫芦素B在抗肿瘤治疗中的作用提供了依据。

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Effects of cucurbitacin B on proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma BGC-823 cells

ZHANG Menga,BIAN Zhi-gangb,HE Pinga*

(a.Department of Geriatrics Medicine,b.Department of Rhinology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of cucurbitacin B on the proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma BGC-823 cells,and to clarify the molecular mechanism.MethodsThe BGC-823 cells were cultured in vitro.MTT assay was used to test the growth inhibitory effect of cucurbitacin B on BGC-823 cells.Apoptosis rate was determined by flow cytometry analysis.Spectrophotometric method was used to determine the activity of Caspase-3 and Caspase-9.The expression of Bcl-2 and Bax was determined by Western blot after cucurbitacin B treatment.ResultsThe growth of BGC-823 cells was inhibited by cucurbitacin B in a dose-and time-dependent manner.Flow cytometry analysis showed that cucurbitacin B could induce BGC-823 cells apoptosis in a dose-dependent manner.The activity of Caspase-3 and Caspase-9 was increased after treatment with cucurbitacin B.The anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated,and the pro-apoptotic protein Bak was up-regulated.ConclusionCucurbitacin B can inhibit the growth of BGC-823 cells and induce cell apoptosis.

Key words：Cucurbitacin B；Gastric carcinoma；Apoptosis

收稿日期：2015-12-20

基金项目：盛京医院院内课题(MD55)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605006