小麦谷蛋白亚基提取方法优化及定量研究

许凌凌

小麦谷蛋白亚基提取方法优化及定量研究

许凌凌

摘要:确定小麦籽粒中麦谷蛋白亚基含量是分析麦谷蛋白亚基对加工品质贡献的一个重要途径，而麦谷蛋白亚基提取方法对亚基定量影响很大。本研究在尝试多种提取条件后，分析麦谷蛋白亚基提取特性，确认20℃和14h为最大化提取HMW-GS和LMW-GS的最适温度和时间。采取此优化的方法提取188份中国小麦微核心种质的麦谷蛋白亚基，分析麦谷蛋白亚基质量分数与SDS沉降值的相关性，结果显示，HMW-GS、B区的LMW-GS和总麦谷蛋白亚基含量对品质影响最大。结合各品种麦谷蛋白亚基含量情况，初步筛选出钱交麦、内麦11、小偃6号和蚂蚱麦4个优质品种，为小麦品质改良提供参考。

关键词:麦谷蛋白亚基；提取方法；优化；定量

小麦谷蛋白由多种亚基组成，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中根据分子量的不同，可分为高、低分子量麦谷蛋白亚基，即HMW-GS和LMW-GS两种，并分布于电泳图谱的A区和B、C、D区[1-3]。研究麦谷蛋白亚基含量与品质的关系，必须精确定量小麦品种中麦谷蛋白亚基[4]，过去由于提取过程中损失较大，因此很难对麦谷蛋白亚基进行定量分析。本研究在尝试多种提取条件后，用SDS-PAGE电泳和凝胶成像系统扫描进行产量对比，分析麦谷蛋白亚基提取特性，优化麦谷蛋白亚基提取方法，为定量研究麦谷蛋白亚基提供依据。在此基础上，以188份中国小麦微核心种质为试验材料，提取其麦谷蛋白亚基，计算各区及总麦谷蛋白亚基质量分数，分析其与SDS沉降值的相关性，明确麦谷蛋白亚基含量与小麦品质之间的关系，并筛选出部分优质品种，为小麦品质改良提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

中国小麦微核心种质188份，来自安徽农业大学农业部黄淮南部小麦生物学与遗传育种重点实验室。

1.2试验方法

1.2.1样品提取

1.2.1.1去除单体蛋白

在20～25℃室温下，称取全麦粉10.0mg倒入1.5mL离心管中，加入100%二甲基亚砜(DMSO)1.4mL，每次提取不超过10个样品，防止一个接一个加DMSO过程中所用时间过长造成麦谷蛋白亚基的损失，该步操作需控制在1min内完成。随后用59KHz超声波清洗器超声样品，超声3次，每次4s(超声全程需保持离心管的2/3部分浸没于水中，这样可以使样品更好地溶于DMSO)。之后迅速放入15000g离心机离心5min，取出后立即将上清液甩掉。紧接着加入70%乙醇1.4mL，用回形针搅起沉淀使之充分悬浮，重复上述超声过程后，静置4min，15000g离心5min，去除上清液。

1.2.1.2提取麦谷蛋白亚基

在沉淀中加入70%乙醇160μL、2-巯基乙醇5μL 和10%SDS10μL，用回形针搅起沉淀悬浮后超声15s。本研究在提取麦谷蛋白亚基过程中，尝试了不同提取温度和时间，分别采用-20℃，-10℃，0℃，5℃，15℃，20℃，25℃，35℃，50℃，65℃，75℃，90℃，提取1min，2min，5min，10min，20min，30min，1h，2h，3h，5h，8h，12h，16h，24h，34h，48h。之后15000g离心2min，将上清液移入另一个1.5mL离心管中，加入160μL SDS缓冲液(0.125M Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.005%溴酚蓝，PH 6.8)，此时样品可直接上样电泳，也可加入4-乙烯吡啶5μL，65℃水浴30min使样品烷基化(分析时可以提高麦谷蛋白亚基的分辨率)，之后上样电泳或-20℃冰箱保存。

1.2.2SDS-PAGE电泳

样品提取后进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶4%，分离胶10%，每个样品点样25μL，电泳系统置于4℃冰箱中控温，15mA恒流约10h，之后固定1.5h，染色24h，脱色24h。

1.2.3凝胶成像系统扫描和定量分析

用凝胶成像系统扫描胶片，以牛血清白蛋白作为标准定量蛋白，通过Quantity One软件将各品种麦谷蛋白亚基和已知浓度的标准蛋白对比，确定每个亚基的质量分数(μg/mg)。根据分子量mark将胶片划分为A、B、C和D共4个区，将每个区域内亚基质量分数相加既得该区麦谷蛋白亚基质量分数，最终计算出各品种高、低分子量麦谷蛋白亚基及总麦谷蛋白亚基的质量分数。对比各提取条件的产量，分析高、低分子量麦谷蛋白亚基的提取特性，从而优化提取条件，达到最佳提取效果。

1.2.4SDS沉降值测定

称取全麦粉3.00g，参考代俊利[5]的方法并略作修改，最终折算成1mg全麦粉的SDS沉降值(μL)。

1.2.5SPSS软件分析

采用SPSS16.0进行数据统计。

2结果与分析

2.1HMW-GS提取条件优化

2.1.1高温条件

采取50℃，65℃，75℃和90℃提取时，HMW-GS分别需约2h，30min，10min和5min即能达到最大提取量，如图1的第3、8、13、18号，延长提取时间反而会造成HMW-GS的损失，如图1的第4、5、9、10、14、15、19、20号。

图1高温条件HMW-GS提取产量变化图

注：1-5为50℃提取30 min，1 h，2 h，3 h，5 h；6-10为65℃提取10 min，20 min，30 min，1 h，2 h；11-15为75℃提取2 min，5 min，10 min，20 min，30 min；16-20为90℃提取1 min，2 min，5 min，10 min，20 min。

2.1.2常温条件

15℃，20℃，25℃和35℃时，在12h内HMW-GS产量随提取时间的延长而增加，温度越高产量增速越快，但不同温度产量增速差别不大，且都能在12h内达到最大提取量。超过12h(12h-48h)，HMW-GS产量随提取时间的延长反而减少，温度越高损失越大。在各常温条件下HMW-GS提取过程中产量变化趋势大致相同。图2显示20℃时提取HMW-GS产量变化情况。

图2常温条件HMW-GS提取产量变化图

注：1-11为20℃提取30 min，1 h，2 h，3 h，5 h，8 h，12 h，16 h，24 h，34 h，48 h。

2.1.3低温条件

-20℃，-10℃，0℃和5℃时随着时间的延长提取量有所增加，但48h依然都未能达到最大提取量，因此低温条件下则可能需要更长时间才能提取出HMW-GS(见图3)。

图3低温条件HMW-GS提取产量变化图

注：1-7为0℃提取5 h，8 h，12 h，16 h，24 h，34 h，48 h。

由上述试验可知，HMW-GS在高温条件下，所需提取时间短，然而提取温度过高则有可能会因为离心管密封性等问题导致提取液蒸发过多而造成损失。在低温条件下所需提取时间过长，不利于试验的进程。而在常温条件下，12h内HMW-GS即可达最大量，因此，可以作为HMW-GS提取的最适温度和时间。

2.2LMW-GS提取条件优化

2.2.1较高温条件

在35℃，50℃，65℃，75℃和90℃条件下，分别尝试了多种提取时间，不仅无法达到LMW-GS的最大提取量，在2h后随着提取时间的延长产量反而有所减少，且温度越高损失越大，较高温度条件下各提取温度产量变化趋势大致相同。50℃时LMW-GS产量变化情况如图4所示。

图4较高温度条件LMW-GS提取产量变化图

注：1-8为50℃提取10 min，20 min，30 min，1 h，2 h，3 h，5 h，8 h。

2.2.2低温常温条件

采取-20℃，-10℃，0℃，5℃，15℃，20℃和25℃提取时，在8h内随着提取时间的延长提取量都增加，不同温度提取量大致相等，而超过8h后随着提取时间延长提取量发生变化。20℃条件下随着时间的延长LMW-GS产量不断增加，16h达到最大产量，随后减少(见图5)。而在-20℃，-10℃，0℃，5℃，15℃和25℃条件下提取时间超过8h后LMW-GS产量都开始减少，且产量减少趋势基本相同(见图6)。

图520℃条件下LMW-GS提取产量变化图

注：1-10为20℃提取1 h，2 h，3 h，5 h，8 h，12 h，16 h，24 h，34 h，48 h。

图625℃条件下LMW-GS提取产量变化图

注：1-8为25℃提取1 h，2 h，3 h，5 h，8 h，12 h，16 h，24 h。

由此，鉴于以上HMW-GS和LMW-GS的提取特性可知，20℃为最佳提取温度。此温度时，HMW-GS提取12h可达最大量，LMW-GS需16h。为兼顾两者都尽可能达到最大提取量，因此，选择14h作为麦谷蛋白亚基的最佳提取时间。

2.3麦谷蛋白亚基质量分数和SDS沉降值的变异

采取优化的方法提取188个品种的麦谷蛋白亚基，电泳后(见图7)用凝胶成像系统进行定量分析，计算出188个品种各区及总麦谷蛋白亚基质量分数并进行统计分析。188个品种麦谷蛋白亚基质量分数和SDS沉降值的平均值、标准差、变异范围和变异系数，以及各区麦谷蛋白亚基所占比例的平均值见表1所示。

图7SDS-PAGE图谱分析

表1麦谷蛋白亚基质量分数(μg/mg)和SDS沉降值(μL)的变异

参数品质性状 平均值标准差最小值最大值变异系数%占总量比例的平均值%A区质量分数8.942.193.2317.1324.5023.75B区质量分数10.642.865.0521.1926.8828.27C区质量分数9.723.122.9423.5332.1025.82D区质量分数8.343.332.5721.3439.9322.16BCD区质量分数28.706.3313.5749.9022.0676.25总质量分数37.647.5416.8067.0420.03-SDS沉降值10.63.123.619.629.43-

A区HMW-GS质量分数平均为8.94μg/mg，占总麦谷蛋白亚基的23.75%，变异系数24.50%。A区质量分数最高的品种为钱交麦，达17.13μg/mg，之后依次为换香果16.95μg/mg，内麦11为 15.03μg/mg，最低为凤麦11，只有3.23μg/mg。

B区LMW-GS质量分数在4区中最高，平均为10.64μg/mg，变幅在5.05-21.19μg/mg 之间，变异系数26.88%。B区质量分数最高的品种依次为钱交麦、小偃6号和蚂蚱麦，最低的为凤麦11、红蜷芒和木宗卓嘎。

C区LMW-GS质量分数平均为9.72μg/mg，变幅为2.94-23.53μg/mg，变异系数32.10%。其中品种钱交麦、秃芒麦、蚂蚱麦和内麦11的质量分数都大于15μg/mg，而成都光头、蚰子麦、济南2号和红须麦的质量分数较低，都不足5μg/mg。

D区LMW-GS质量分数在4区中最低，平均为8.34μg/mg，变异系数却最高，为39.93%。其中早小麦质量分数最低为2.57μg/mg，而金麦4号却高达21.34μg/mg，是前者的8.30倍，变幅较大。

BCD区LMW-GS质量分数主要分布于13.57-49.90μg/mg范围内，占总量的76.25%。凤麦11质量分数最低，只有13.57μg/mg，之后为边巴春麦6、小三月黄和红花麦。质量分数超过40μg/mg的品种有贵农10号、蚂蚱麦、云麦34、小偃6号和钱交麦。

总麦谷蛋白亚基质量分数平均为37.64μg/mg，变幅为16.80～67.04μg/mg，其中品种木宗卓嘎、边巴春麦6、同家坝小麦和偃展1号的质量分数都不足25μg/mg，而品种内麦11、车锏子、蚂蚱麦、小偃6号和钱交麦的质量分数都超过50μg/mg，是前者的2倍，差距较大。

SDS沉降值平均为10.6μL，变异范围在3.6-19.6μL，蚂蚱麦、小偃6号、内麦11和钱交麦的SDS沉降值都大于16.0μl，而泰山1号、小口红、晋麦8号和小白麦都低于6.0μl。

2.4麦谷蛋白亚基质量分数与SDS沉降值的相关分析

表2　麦谷蛋白亚基质量分数与SDS沉降值的相关系数

**P<0.01

由表2可知，各区及总麦谷蛋白亚基质量分数都与SDS沉降值呈正相关，其中A区、B区、C区、BCD区和总量与沉降值呈极显著正相关，D区正相关不显著。A区相关系数最大，为0.673，之后依次为总量0.607、B区0.596、BCD区0.490和C区0.399，D区最小，只有0.0446。

3讨论

麦谷蛋白亚基是小麦的重要组成部分，与小麦加工品质关系密切，然而要充分发挥麦谷蛋白亚基的加工品质潜力，亚基必须达到一定的含量[6-8]。过去由于麦谷蛋白亚基在提取过程中损失较大，所以很难就麦谷蛋白亚基含量对小麦品质的影响作深入研究。

本研究通过对HMW-GS和LMW-GS提取特性的探索，基本确认了20℃和14h为最大化提取HMW-GS和LMW-GS的最适温度和时间，优化了麦谷蛋白亚基提取方法。之后采取此方法对188份中国小麦微核心种质进行提取，计算各区麦谷蛋白亚基质量分数及比例，分析显示A区和BCD区各占总麦谷蛋白亚基的23.75%和76.25%，和Naeem等[9]提出麦谷蛋白中20%为HMW-GS和80%为LMW-GS的研究结果基本一致，说明此方法能提取出绝大部分的麦谷蛋白亚基，因此可用于麦谷蛋白亚基的定量研究。

统计分析显示A、B、C、D、BCD区和总麦谷蛋白亚基质量分数变异范围分别为3.23-17.13μg/mg，5.05-21.19μg/mg，2.94-23.53μg/mg，2.57-21.34μg/mg，13.57-49.90μg/mg和16.80-67.04μg/mg。变异系数分别为24.50%，26.88%，32.10%，39.93%，22.06%和20.03%，变异系数都大于20%，根据袁志发等[10]以变异系数为0-10%、10%-20%和20%-30%表示变异度较小，中等和较大的分类标准，说明品种间麦谷蛋白亚基质量分数的变异幅度和变异系数都较大，因此可以有效选择优良的育种材料。

SDS沉降值作为反映面筋质量优劣的重要指标，可以用于评价小麦品种的品质性状[11-13]。通过麦谷蛋白亚基质量分数与SDS沉降值的相关分析可知，A区、B区、C区、BCD区及总麦谷蛋白亚基质量分数与沉降值呈极显著正相关，D区与沉降值不显著正相关，因此，小麦品种具有较高的HMW-GS含量、LMW-GS含量和总麦谷蛋白亚基含量都有利于小麦品质的提高。分析显示A区、B区和总量与沉降值的相关系数较高，均在0.5-0.8之间，为中度相关[14]，由此可见HMW-GS、B区的LMW-GS和总麦谷蛋白亚基含量对品质的影响最大。根据各品种麦谷蛋白亚基含量情况，初步选出钱交麦、内麦11、小偃6号和蚂蚱麦为优良品种。但研究中发现A区麦谷蛋白亚基含量与SDS沉降值相关系数最大，而含量在4区中并不是最高，B区含量最高，与沉降值的相关系数却不是最大，因此仅凭麦谷蛋白亚基含量大小还不能完全决定小麦品质的优劣，下一步还将结合亚基组成对品质的影响，从而最终筛选出优良的品种，为小麦品质改良工作奠定基础。

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责任编辑：王与

Optimization of Extraction Method and Quantification Research for Wheat Glutenin Subunits

Xu Lingling

Abstract:It is an important approach to determine glutenin subunits content in wheat grain for analysing the contribution of subunits to processing quality, however, the extraction method of glutenin subunits has a great influence on the quantification. The extraction characteristics of glutenin subunits were mastered after several attempts, 20℃ and 14 hours were established as the optimum temperature and time for maximum extraction of HMW-GS and LMW-GS. The glutenin subunits of 188 Chinese wheat mini core collections were extracted by this optimizing method. The results of correlation analysis showed that the content of HMW-GS, B-LMW-GS and total glutenin subunits had a big effection on the SDS sedimentation volume. Qianjiaomai, Neimai 11, Xiaoyan 6 and Mazhamai were screened as good processing quality traits donors could be used in wheat quality improvement.

Key words:glutenin subunits, extraction method, optimization, quantification

中图分类号：S512.1

文献标识码：A

文章编号：1673-1794(2016)02-0075-05

作者简介：许凌凌，芜湖职业技术学院生物工程学院讲师，硕士(安徽 芜湖 241002)。

基金项目：安徽省教育厅2016年度高校自然科学研究重点项目：安徽黄山太平湖滩涂湿地细菌宏基因组学研究(KJ2016A761)阶段性成果；芜湖职业技术学院2015年度院级科学研究项目：小麦谷蛋白亚基提取方法开发、组成鉴定及与品质关系的研究(Wzyzr201505)阶段性成果

收稿日期：2016-01-14