协同负载阿司匹林/普罗布考的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的制备研究

孙　燕，刘金华，杜　悦，徐冰倩，卢陈杰，韩茜茜，谢泽睿，夏　龙

(杭州师范大学钱江学院，浙江 杭州 310036)

协同负载阿司匹林/普罗布考的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的制备研究

孙燕，刘金华，杜悦，徐冰倩，卢陈杰，韩茜茜，谢泽睿，夏龙

(杭州师范大学钱江学院，浙江 杭州 310036)

摘要：利用壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶，同时负载阿司匹林和普罗布考两种性质差异显著的药物，探索实现阿司匹林/普罗布考复合药物协同包埋的最佳条件.结果显示，当阿司匹林与普罗布考的质量浓度比为2∶1、海藻酸钠与壳聚糖的质量浓度比为1∶2时，协同负载普罗布考和阿司匹林的效果最佳，其包封率分别为96.33%和98.35%；并且表面电位为-13.94 mV，储存稳定性较好.

关键词：阿司匹林；普罗布考；壳聚糖；海藻酸钠；复合水凝胶

0引言

阿司匹林(ASA)和普罗布考(PRO)是两种应用广泛和效果显著的抗血栓药物.PRO又称丙丁酚，具有调节血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、预防动脉缩小等作用，对很多常见的疾病都有很好的治疗作用[1].小剂量的ASA就具有较好的抗血栓作用，但ASA多数时候需要长期甚至终生服用.ASA口服过程中最大的问题是因集中释药，使局部药物浓度过高，在体内水解成水杨酸后对胃肠道黏膜有刺激作用[2-3]，严重时甚至出现水肿、糜烂溃疡和出血的现象.所以对ASA和PRO的剂型方面的研究是目前较活跃的领域[4-5].

药物剂型的研究离不开高分子材料.天然高分子材料中，壳聚糖(CS)和海藻酸钠(ALG)是应用较成熟的两种[6].CS是自然界中唯一带正电的碱性多糖，由贝壳类生物中的甲壳素经脱乙酰化反应而得,具有良好的粘合性、生物相容性和生物降解性[7]，以及无毒无味无免疫抗原反应等特点，目前被广泛应用于医药、食品、化工等领域.ALG也是一种天然的生物多糖，是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇后的副产品，具有无毒、无味等特点，生物相容性也很好，常被用于生物医用领域[8].

本研究拟利用壳聚糖和海藻酸钠这两种高分子材料对ASA和PRO两种药物进行协同包埋，以期提高两种药物的利用效率，并降低药物毒副作用.

1实验部分

1.1药品与仪器

ASA、PRO、醋酸、无水氯化钙、CS、ALG、二氯甲烷、乙醇，均为市售的分析纯或生物纯.仪器有紫外可见分光光度计，傅里叶红外光谱分析仪，马尔文Zetasizer Nano ZS90，贝克曼Delsa Nano C，差示扫描量热仪，台式离心机.

1.2协同负载ASA/PRO的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的制备

将ALG溶于去离子水中分别配制成质量浓度为1、2和3 mg/mL的ALG水溶液.将一定量的ASA溶解到ALG水溶液，待ASA完全溶解后，再充分搅拌0.5 h.称取一定量的PRO溶解于一定体积的二氯甲烷中，搅拌让其充分溶解.将PRO的二氯甲烷溶液逐滴滴加到溶有ASA的ALG溶液中，待PRO完全溶解在溶液中，再继续搅拌0.5 h.

将CS溶于2%的稀醋酸溶液中，配成质量浓度为1 mg/mL的CS醋酸溶液；将一定量的CS稀醋酸溶液，分别对应滴入到溶有ASA和PRO的ALG溶液，待CS全部滴完，继续搅拌0.5 h，并控制溶液pH=5.5，所得溶液呈蓝色荧光.

2性能测试与表征

2.1PRO和ASA包封率的测定

将样品在15 ℃下超离心(18 000 r/min)30 min，分离出纳米粒子，将其冷冻干燥.上层清液用紫外分光光度仪测定波长为242 nm(PRO)和296 nm(ASA)处的吸收，计算游离的PRO和ASA 的量，用未包封PRO和ASA 的纳米粒子作校正曲线.

纳米粒子对药物的包封率=(加入药物的总质量-游离药物的质量)/加入药物的总质量×100%.

每种试样同时测5个平行样，计算平均值.

2.2差示扫描量热(DSC)分析

准确称取5 mg冷冻干燥样品，用KBr进行压片，然后进行DSC分析.设置程序控温：从室温升温到100 ℃，恒温5 min；然后从100 ℃降温到-30 ℃，并恒温5 min；最后从-30 ℃升到300 ℃(升温或降温速度均为10 ℃/min).

2.3粒径分布和Zeta电位分析

纳米粒子的平均水合粒径通过PCS粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS90)测试.每个样品平行测定5次，取平均值.

纳米粒子溶液的Zeta电位通过微电子电泳和一个Zeta Plus与Zeta电位分析仪(Delsa Nano C)来确定.测定方法如下：将样品用软化水稀释，使得样品与软化水的比例为1∶40，所有的结果都在参考温度25 ℃下转化为标准值.每批样品平行测定5次，取平均值.

3结果与讨论

3.1PRO和ASA的包封率研究

本研究主要讨论3个变量的影响(表1)，其一是ALG的质量浓度，如1、2和3 mg/mL，分别用符号A1、A2和A3表示；其二是ASA和PRO的质量浓度比，如1∶1、2∶1和1∶2，分别用符号B1、B2和B3表示；其三是ALG和CS的溶液的质量浓度比，如1∶1、2∶1和1∶2，分别用符号C1、C2和C3表示.

表1　研究变量

图1　普罗布考和阿司匹林的包封率Fig. 1　Entrapment efficiency of PRO and ASA

图1为在表1所示的控制变量下，所获得的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶对两种药物PRO和ASA的包封率.由图1可以看出PRO和ASA包封率曲线的几个明显特征.

首先，与PRO的包封情况相比，壳聚糖/海藻酸钠水凝胶对ASA的包封效果普遍显著.

其次，当海藻酸钠配制质量浓度较小(1 mg/mL)，且当CASA/PRO≥1时，无论海藻酸钠和壳聚糖的质量浓度比是大于还是小于等于1(如CALG/CS=1∶1，2∶1和1∶2)，壳聚糖/海藻酸钠水凝胶对PRO和ASA两种药物都显示出较好的包封效果(1#～6#)；当海藻酸钠配制质量浓度继续增大(2和3 mg/mL)，且当CASA/PRO<1(如CASA/PRO=1∶2)时，PRO和ASA两种药物的包封率也较高(16#～18#，25#～27#).壳聚糖/海藻酸钠水凝胶对ASA的包封率比对PRO的包封率普遍高的原因，可能是ASA为水溶性药物，水凝胶可以与ASA形成离子交联作用；而PRO为油溶性药物，其跟CS和ALG都形成不了作用，只能靠物理包埋作用进入到水凝胶.

最后，由图1可见另外3个比较重要的区别：1)当海藻酸钠配制质量浓度为1 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=1∶2时(6#)，PRO和ASA的包封率都达到最大值，其值分别为96.33%和98.35%.出现这种结果的原因可能是当CALG/CS=1∶2时，除了CS能够很好地与ALG形成致密的离子交联作用，从而通过物理作用将PRO包裹到凝胶中外，多余的CS也能很好地通过与ASA作用将其包裹在其中.2)当海藻酸钠的配制质量浓度由1 mg/mL(6#)增加到3 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=2∶1时(23#)，壳聚糖/海藻酸钠水凝胶对PRO和ASA两种药物的包封效果却出现逆转，ASA和PRO的包封率最低，分别为46.01%和59.58%，这可能是因为海藻酸钠的初始配制质量浓度过高，减弱了海藻酸钠与壳聚糖之间的离子交联作用，使得形成的水凝胶对药物的负载效果变差.3)当海藻酸钠配制质量浓度为2 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=2∶1时(14#)，PRO和ASA的包封率差值最大，分别为54.01%和89.82%.在此条件下，由于ASA的浓度比PRO大，可以与带正电的壳聚糖形成很好的交联作用，从而削弱了海藻酸钠与壳聚糖的相互作用，所以ASA的包封率比PRO的要大得多.

3.2壳聚糖/海藻酸钠载药复合水凝胶的TEM研究

图2为负载两种药物的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的TEM照片.由图2A所示空白不负载药物的壳聚糖/海藻酸钠水凝胶的TEM照片可见，形成的水凝胶尺寸较小，结构较致密.两种药物包封率最差的23#样品的TEM照片显示(图2B)，基本没形成较好的包裹结构，且有很多药物聚集颗粒分散.两种药物包封差距最大的复合水凝胶的TEM照片(图2C)显示，有尺寸较大的结构较致密的复合水凝胶微球形成，且有明显的药物聚集颗粒(呈白点)分散在黑色微球周围，这可能是未包裹的PRO形成的.图2D所示的是PRO和ASA两种药物包封效果均最好的复合水凝胶的TEM照片，可以看出，载药复合水凝胶虽然形状不规则，但是结构较致密.

3.3壳聚糖/海藻酸钠载药复合水凝胶的粒径分布和Zeta电位分析

A:0#; B:23#; C:14#; D:6#.图2　负载PRO/ASA药物的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的电镜照片Fig. 2　TEM of PRO/ASA loaded CS/ALG compositehydrogels

表2所示为空白和载药的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的粒径分布和Zeta电位值.其中空白不载药的复合水凝胶(0#)的平均水合粒径为(354.10±6.76) nm，Zeta电位为(-15.82±0.05) mV，说明纳米水凝胶颗粒表面覆盖着带负电的海藻酸钠，而带正电的壳聚糖分子在纳米水凝胶的内核.而当负载PRO和ASA后，复合水凝胶的粒径迅速增大，如当两种药物都包封最好时(6#)的粒径达到了(845.90±7.08) nm.这可能是由于ASA与壳聚糖之间的作用削弱了壳聚糖与海藻酸钠的相互作用，导致其离子交联作用减弱的缘故.同时凝胶纳米颗粒的表面电位为(-13.94±0.17) mV，其绝对值比空白凝胶纳米表面电位值小，这也正说明了部分壳聚糖跟ASA发生了作用，导致与海藻酸钠的作用能力降低.而药物负载最差(23#)和差异最大(14#)的两个样品的复合纳米水凝胶的粒径更大，分别为(857.70±7.46)和(950.10±10.82) nm，并且表面电位都发生了反转，变为正值，分别为(11.12±0.39)和(0.59±0.03) mV.这说明，形成的纳米粒子表面被壳聚糖分子缠绕，其中23#的电位正值较高，可能的原因是带负电的ASA药物和海藻酸钠没有很好地跟壳聚糖发生作用.而14#凝胶纳米表面电位接近0，可能的原因在于，壳聚糖虽然不一定跟海藻酸钠发生较好的作用，但是一定跟ASA之间发生了很好的作用，导致其对ASA的包封效果很突出.

表2　凝胶纳米粒子的粒径分布和Zeta电位

3.4载药复合水凝胶的差示扫描量热法(DSC)分析

图3　负载PRO/ASA药物的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶的DSC谱图Fig. 3　The DSC spectrogram of PRO/ASA loaded CS/ALG composite hydrogels

负载ASA/PRO的CS/ALG复合水凝胶的DSC分析如图3所示，纯的PRO在125 ℃左右有个强吸热峰，是PRO的熔融温度；纯的ASA在140 ℃左右有个强吸热峰，是ASA的熔融温度.复合水凝胶负载PRO和ASA两种药物后，在120 ℃左右都有个小的吸热峰，这应该也是PRO药物分子的晶体熔融峰，从而可以说明PRO是以物理包埋的形式包裹在凝胶中的.在140 ℃左右没有出现吸热峰，说明ASA分子不是以晶体形式存在，与其他物质发生了相互作用.另外，包封最好的样品(6#)上没有出现ASA的熔融峰；但是药物包封最差的样品(23#)上在135 ℃左右出现一个小的吸热峰，可能是ASA的熔融导致，这说明ASA没有与其他物质发生离子交联作用，因此没有被很好地包裹到水凝胶中.

4结论

壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶粒子对PRO和ASA的最佳包埋条件为CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=1∶2(6#即A1B2C3变量)，此时PRO和ASA的包封率最高，分别为96.33% 和98.35%；并且表面电位为-13.94 mV，储存稳定性较好.

参考文献:

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Preparation of Composite Hydrogels Composed of Chitosan and Sodium Alginate Loaded Aspirin/Probucol

SUN Yan, LIU Jinhua, DU Yue, XU Bingqian, LU Chenjie, HAN Xixi, XIE Zerui, XIA Long

(Qianjiang College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:This study aims to use the composite hydrogel composed of chitosan and sodium alginate for loading aspirin and probucol, which are different largely in nature. Here, the optimum conditions for composite loading aspirin and probucol are explored. The results show that when the concentration ration between aspirin and probucol is 2∶1, and the concentration ratio of sodium alginate and chitosan is 1∶2, the best loading capability of drug is obtained. The encapsulation efficiency of probucol and aspirin are 96.33% and 98.35%, respectively, and the surface potential for drug loaded chitosan/sodium alginate hydrogels is -13.94 mV, which shows the better stability.

Key words:aspirin; probucol; chitosan; sodium alginate; composite hydrogel

收稿日期：2015-07-29

基金项目：国家自然科学青年基金项目(50903026)；杭州师范大学钱江学院2014年度学生科研基金项目(2014QJXS36).

通信作者：孙燕(1978—)，女，副教授，博士，主要从事生物医用高分子研究.E-mail:sunyan19hsz@126.com

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.03.005

中图分类号:TQ314.1

文献标志码:A

文章编号:1674-232X(2016)03-0247-05