超声经皮促渗术联合骨伤膏对创伤性骨折愈合兔血清碱性磷酸酶活性水平及钙、磷含量的影响※

冉仁国　罗　政　张岱阳　刘　俊　黄　琼

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院骨外科，湖北　恩施　445000)

实 验 研 究

超声经皮促渗术联合骨伤膏对创伤性骨折愈合兔血清碱性磷酸酶活性水平及钙、磷含量的影响※

冉仁国罗政△张岱阳刘俊黄琼1

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院骨外科，湖北恩施445000)

【摘要】目的观察超声经皮促渗术联合骨伤膏对创伤性骨折愈合兔血清碱性磷酸酶(AKP)活性水平及钙、磷含量的影响。方法将80只雄性健康新西兰兔随机分为超声经皮促渗术联合骨伤膏组(简称联合组)和单纯骨伤膏对照组(简称对照组)，每组40只，均建立右侧桡骨骨折模型，以治疗第 2、4、6、8 周4个时间点将每组动物随机等分成4个小组，每组10 只，联合组所有动物右侧骨折部位给予超声经皮促渗术联合骨伤膏治疗，对照组右侧骨折部位单纯给予骨伤膏治疗。2组在治疗第 2、4、6、8 周4 个时间点，各取相应时间点的10 只动物进行血清碱性磷酸酶(AKP)活性水平及钙、磷含量测定，X 线影像学检查，组织切片和形态学检测。结果联合组实验兔治疗第2、4、6、8周血清AKP活性水平及钙、磷含量均高于对照组治疗同期(P<0.05，P<0.01)，随着时间的推移，治疗第6、8周，联合组上述指标水平变化更明显(P<0.01)。2组实验兔治疗第2、4、6、8周X线评分比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，联合组X线评分高于对照组。2组治疗第4 、8周骨折断端的矿化骨痂均宽(AWMC)及矿化骨痂面积(MCA)比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，联合组高于对照组。结论超声经皮促渗术联合骨伤膏通过对骨折愈合的整个过程施加影响从而加速了骨折的愈合。

【关键词】创伤和损伤；骨折愈合；动物，实验；超声检查，介入性；膏剂；碱性磷酸酶；骨和骨组织

日常生活中，骨折是一种常见的创伤性疾病，其愈合涉及非常复杂的生物组织学过程，以骨组织形态和功能完全恢复作为骨折愈合的标志[1]。随着人口老龄化的到来，骨折的发生率和延迟愈合率均不断增高，由此导致的骨移植等辅助治疗在精神及物质上均给患者带来非常大的痛苦，因此对如何促进骨折愈合的研究显得尤为重要，近年来植骨术甚至基因给药等方法在骨折愈合领域的应用获得了一定的进展，但仍不能很好地解决上述问题[2]。国外近年出现了一种低频超声波介导经皮给药的新技术，该项技术基于无创靶向渗透给药理论，通过超声空化和电致孔等技术，克服了皮肤、组织膜和细胞膜等屏障，较好地使药物渗透进皮肤组织和体循环，达到发挥药效之目的[3-4]。骨伤膏是土家族地区常用的骨科用药，经湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院骨科临床应用具有较好的疗效，可缩短骨折愈合时间和提高骨折愈合质量，但单纯应用该方疗效发挥较缓慢。为更好地发挥骨伤膏的作用，我们应用超声经皮促渗术将骨伤膏定向渗透进骨折部位，用动物实验方法观察超声经皮促渗术联合骨伤膏对骨折愈合的影响，为骨伤膏更好地服务临床、发挥临床疗效奠定一定的理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性健康纯种新西兰兔80只，体质量(2.25±0.25) kg，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物合格证号：SKSF(鄂)20140605。饲养在空调恒温室内，温度为(22±2) ℃，湿度为40%～60%，自由饮水，每日光照12 h。

1.1.2实验仪器SLC-006型超声脉冲电导治疗仪(河南三浪医疗新技术有限公司)，治疗参数：电致孔脉冲持续时间(200±10) ms，超声波频率(1±0.1) MHz，中频输出频率(2±0.2) KHz，低频输出频率50 Hz，允差±0.1，额定输出功率≤100 VA。

1.1.3实验药物骨伤膏由湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院药剂科制备，鄂药准字Z20121360，由本地产特有植物药刺老苞、野葡萄、刺五加、蜂蜜按2∶1∶1∶4的比例，先将刺老苞、野葡萄、刺五加粉碎，再加入蜂蜜，并加适量凡士林膏调和而成，装塑料盒备用。

1.2方法

1.2.1动物选择将80只实验兔随机分为超声经皮促渗术联合骨伤膏组(简称联合组)和单纯骨伤膏对照组(简称对照组)，每组40只，以治疗第 2、4、6、8 周4个时间点将每组实验兔随机分为4个小组，每组10只。

1.2.2模型制备每只实验兔用5%戊巴比妥钠1 mL/kg静脉麻醉，将右侧前臂肤毛剪除，常规酒精消毒，在右侧桡骨中段纵向切开1个2.0 cm切口，并将骨膜剥离，用消毒后的线锯将骨膜和桡骨锯断，并造成1个3 mm 的骨缺损，然后将伤口逐层缝合，不予固定，造模后3 d予注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，国药准字H13020657)50万U，每日1次肌肉注射。

1.2.3治疗方法造模后，观察伤口情况，如伤口干燥，则可按前述分组进行治疗。联合组实验兔右侧骨折部位给予超声经皮促渗术联合骨伤膏治疗，用药剂量按体表面积公式和等效临床剂量计算，每只实验兔取骨伤膏30 g，此剂量与人的等效剂量相当，用一定量0.9%氯化钠注射液稀释后平摊于医用纱布上，然后包裹在骨折部位，外包连接超声脉冲电导治疗仪的电极板，由阴极导入，连接阳极的电极板用0.9%氯化钠注射液浸湿后置于离骨折部位10 cm的桡骨两端，外用绷带胶布固定，超声脉冲电导治疗仪持续治疗40 min，电致孔脉冲强度设为5，超声波强度设为7，每日治疗1次。对照组实验兔右侧骨折部位单纯给予骨伤膏外敷治疗，方法同联合组的骨伤膏治疗。

1.2.4观察指标

1.2.4.1血清碱性磷酸酶(AKP)活性水平及钙、磷含量测定治疗第2、4、6、8 周相应组实验兔处死前通过心脏采血制备血清，酶联免疫吸附测定(ELISA)测定血清AKP活性水平，滴定分析法测钙、磷含量，步骤操作严格按试剂盒说明书进行。

1.2.4.2X线影像学检测治疗第2、4、6、8 周，相应组实验兔行正位X 线摄片，X线摄片下用评分的方法半定量分析每组实验兔外骨痂和骨折线变化，将半定量分析后的数值相加即为骨折愈合质量的X 线评分，具体评分标准见表1。

表1　X线外骨痂和骨折线评分标准

1.2.4.3组织切片和形态学检测X 线影像学检测后，处死动物，以骨折线为中心，左右截取0.5 cm 长的一段标本，中性甲醛液固定48 h，酸类混合脱钙液脱钙，石蜡包埋，取骨痂最大处切片，苏木精-伊红染色法(HE)染色，100倍光镜下观察骨痂部位组织学变化，并于治疗第4、8周时测定标本的矿化骨痂均宽(The average width of mineralized bone callus，AWMC)和矿化骨痂面积(Mineralized callus area，MCA)。

2结 果

2.12组实验兔治疗第2、4、6、8周血清AKP活性水平及钙、磷含量比较见表1。

表1　2组实验兔治疗第2、4、6、8周血清AKP活性水平及钙、磷含量比较　±s

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表1可见，联合组实验兔治疗第2、4、6、8周血清AKP活性水平及钙、磷含量均高于对照组治疗同期(P<0.05，P<0.01)，随着时间的推移，治疗第6、8周，联合组上述指标水平变化更明显(P<0.01)。

2.22组实验兔治疗第2、4、6、8周X 线评分比较见表2。

表2　2组实验兔治疗第2、4、6、8周X 线评分比较　分，

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表2可见，2组实验兔治疗第2、4、6、8周X 线评分比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，联合组X 线评分高于对照组。2组影像学比较：治疗第2周，联合组外骨痂显现明显，骨折线连接明显；对照组骨膜稍有变化，骨折线欠明晰。治疗第 4 周，联合组外骨痂吸收开始，骨折线消失；对照组仅皮质骨桥形成，骨折线连接明显。治疗第 6 周，联合组外骨痂吸收明显，骨髓腔密度下降显著；对照组外骨痂吸收刚开始，骨折线消失。治疗第 8 周，联合组外骨痂几乎吸收完全，骨髓腔再通；对照组外骨痂吸收不完全，骨髓腔密度显著下降，但未完全通畅。

2.32组实验兔治疗第2、4、6、8周骨痂组织光镜下形态表现治疗第2周，联合组骨折处有纤维骨痂和软骨骨痂形成，有些地方出现膜内化骨(见图1)；对照组骨折处未见纤维骨痂和软骨骨痂形成(见图2)。治疗第4周，联合组骨折处软骨骨痂开始增多，存在较多的破骨细胞，而且部分区域开始出现钙化和骨化(见图3)；对照组骨折处软骨骨痂数量较少，且钙化和骨化不明显(见图4)。治疗第6周，联合组骨折处出现大量的小梁骨，软骨骨痂已很少，骨髓腔密度下降显著(见图5)；对照组膜内化骨明显，但骨痂仍然以编织骨为主，骨髓腔密度下降不显著(见图6)。治疗第8周，联合组骨折处基本恢复正常结构，全部由小梁骨相连，骨髓腔再通完全(见图7)；对照组骨折处正常结构恢复不完全，纤维骨痂减少明显，骨髓腔未完全再通(见图8)。

图1 治疗第2周联合组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图2 治疗第2周对照组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图3 治疗第4周联合组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图4 治疗第4周对照组骨痂部位组织学观察(HE,×100)

图5 治疗第6周联合组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图6 治疗第6周对照组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图7 治疗第8周联合组骨痂部位组织学观察(HE,×100)图8 治疗第8周对照组骨痂部位组织学观察(HE,×100)

2.42组实验兔治疗第4、8周骨折部位形态计量学比较见表3。

表3　2组实验兔治疗第4、8周骨折部位形态计量学比较　±s

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表3可见，2组治疗第4、8周骨折断端的AWMC及MCA比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，联合组高于对照组。

3讨论

骨折愈合涉及生物组织学、生物力学等多学科，是一个较为复杂的过程[5]。长期的临床实践已充分证明中医药在骨折治疗方面具有很大的优势,相应的中医药治疗手段已广泛应用于临床[6-7]。骨伤膏是土家族地区广泛使用的骨科用药，主药刺老苞具有祛风止痛、解毒活血、健骨疗伤之功；野葡萄化瘀止痛，解毒活血；刺加皮祛风止痛，强健筋骨[8-10]；蜂蜜调敷，使药物功效延长。超声经皮促渗术通过电致孔、超声空化等高端物理手段，在皮肤、组织和细胞膜之间形成特定的人工生物通道，再通过超声波对流转运、辐射压等功能的强力驱动作用，使药物沿人工生物通道直接进入病变的器官和组织，并在局部迅速形成药物高浓度浸润区，促进药物向细胞内转运，直接发挥药物的治疗作用，这一手段被医药界称为第三代给药方法[11-12]。为进一步加强骨伤膏的临床疗效，本实验将骨伤膏与超声经皮促渗术联合起来应用，以探讨如何更好地发挥骨伤膏在骨伤科领域的应用。

实验结果显示，从术后第2周开始，联合组的实验兔骨折部位X线摄片与对照组比较骨折愈合情况愈发显著，从术后第2、4、6、8 周光镜观察结果和术后第4、8周骨折部位形态计量学分析也进一步说明了超声经皮促渗术联合骨伤膏这一新的给药方法对加快骨痂生成、骨骼重塑及加速骨折愈合具有很好的促进作用。作为骨生成所必需的酶, AKP是考察骨折愈合的常用指标[13]，其活性强弱反映了成骨细胞活动性的强弱和骨组织结构再建的活跃性，而钙、磷是骨折愈合的要素之一，可促进钙盐沉积，加速骨折愈合，其血清浓度高低反映了骨折愈合能力的强弱[14-15]。对实验兔血清学的检测结果说明联合组无论血清AKP活性水平还是钙、磷含量均明显高于对照组同期。

综上所述，超声经皮促渗术联合骨伤膏不仅对骨愈合的某一特定阶段产生作用，而且对骨折后的炎症期、愈合期和塑形期这一骨折愈合的整个过程施加了有益的影响。该联用技术可使药物利用率提高，药物用量减少，药物不良反应下降，治疗方法安全有效，其在骨伤科相关疾病中的应用还需进一步的研究与推广。

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(本文编辑：习沙)

Effects of ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on alkaline phosphatase activities, calcium and phosphorus content in rabbit with traumatic bone fracture healing

RANRenguo,LUOZheng,ZHANGDaiyang,etal.

DepartmentofBoneSurgery,EnshiTujiaandMiaoAutonomousPrefectureCenterHospitalinHubeiProvince,Hubei,Enshi445000

【Abstract】Objective To observe the ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on alkaline phosphatase (AKP) activities, calcium (Ca) and phosphorus (P) content in rabbit with traumatic bone fracture healing. Methods 80 male New Zealand Rabbits were randomly divided into combination group and control group, 40 rabbits in each group, and then the right radius fractures models were established. Rabbits of the two groups were divided into four group according to different time-points of 2, 4, 6, 8 weeks after treatment, 10 rabbits in each group．The combination group received ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on the fracture area, and the control group received simple Gushang paste. The contents of AKP, Ca and P of 2, 4, 6, 8 weeks after treatment were detected in corresponding group of combination and control group, respectively, as well as the X-ray examination, tissue section and morphological assay. Results The contents of AKP, Ca and P 2，4，6，8 weeks after treatment in combination group were higher than those in control group (P<0.05，P<0.01), and the changes of such contents,8 weeks after treatment were more obvious as the time passage in combination group(P<0.01). There was statistical difference on the X-ray score among 2, 4, 6, 8 weeks after treatment in two groups (P<0.05，P<0.01), and the scores in combination group were higher than those in control group. There were statistical differences on average width of mineralized bone callus (AWMC) and mineralized callus area (MCA) of fracture side between 4 and 8 weeks after treatment in two groups (P<0.05,P<0.01), the AWMC and MCA in combination group were higher than those in control group. Conclusion Ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste has the acceleration and promote effects in the whole process of fracture healing.

【Key words】Trauma and injury; Fracture healing; Animals; Experiment; Ultrasonic testing; Interventional; Paste; alkaline phosphatase; Bone and bone tissues

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.05.023

通讯作者：△湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院骨外科，湖北恩施445000

作者简介：冉仁国(1967—)，男，副主任医师，副教授。从事中西医结合对骨伤科疾病的防治研究工作。

【中图分类号】R287；R641；R-332；R683；R683.41

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)05-0720-05

(收稿日期：2014-10-13)

※ 项目来源：国家自然科学基金委员会2013年度第二批项目(编号：81360570)

1湖北民族学院中医药学院中医基础教研室，湖北恩施445000