D型肉毒毒素冻干剂的试验

刘生财，张西云，胡国元，范玉霞，李生庆，李秀萍，王亭亭，李志宁，黄　荣，刘怀新（青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810016）



D型肉毒毒素冻干剂的试验

刘生财，张西云，胡国元，范玉霞，李生庆，李秀萍，王亭亭，李志宁，黄荣，刘怀新
（青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810016）

摘要：通过保护剂的选择及冻干试验研制了D型肉毒毒素新剂型-D型肉毒冻干剂。试验确定30%蔗糖+10%明胶作为冻干剂的保护剂；室温（13℃～18℃）的保存期为10个月，37℃的保存期为6个月；水分含量为≤5%。同时制定了D型肉毒毒素冻干剂冻干曲线。

关键词：D型肉毒毒素；保护剂；保存期；冻干曲线

D型肉毒灭鼠剂是青海省畜牧兽医科学院利用该院从动物体内分离、鉴定的D型肉毒梭菌，经透析培养、除菌过滤研制的一种生物灭鼠剂，经试验及使用证明，灭鼠效果良好，且具有不污染环境、无二次中毒及不伤害鼠类天敌的特点，但存在必须低温保存、运输及常温下保存期短的弊端。

为增加剂型，扩大灭鼠范围，延长常温下的保存期，且便于运输、保存、使用，我们进行了D型肉毒毒素冻干剂的试验，并取得了较好的结果，报告于下。

1　材料与方法

1.1毒素的制备经透析培养、离心过滤、无菌检验及毒价测定后，用无菌蒸馏水配制成2 000 万MLD/mL毒素。

1.2保护剂的制备（1）50%蔗糖；（2）30%蔗糖+ 10%明胶；（3）30%蔗糖+ 10%脱脂乳粉；（4）30%蔗糖+10%可溶淀粉。按毒素量的1/5分别配制上述保护剂，充分溶解后，高压10磅40 min，备用。

1.3自动灌装机使用前经无菌处理后，备用。

1.4塑料瓶，硅胶塞用前清洗，晾干水分后，高压10磅40 min备用。

1.5冻干机日本产Blender冷冻机。

1.6水分测定仪。

1.7D型肉毒灭鼠剂冻干保护剂试验冻干毒素按5份毒素+1份保护剂制备。将配制好的毒素液，分装到25 mL瓶中，每瓶装量6 mL。冷冻室放入各样品和对照瓶（加水6 mL），按照说明放置好各探头，关闭冷冻室门。打开电源，调最高温度30℃，最低温度-30℃。启动冷冻机，先制冷到-30℃，持续3 h，然后进行抽真空，真空度达到100 μm以上时，升温升华，直到30℃，完成一个周期。之后再重复制冷-升华全过程。（升华时从-30℃开始，制冷室温度要达到-52℃、真空度为90～100 μm之间）。完成全部冻干需时16 h以上，待对照瓶内水完全升华即结束。每瓶约抽2 min，真空度达300 μm时，用石蜡封口。根据毒素冻干后的性状、溶解性及毒价，确定毒素冻干用保护剂的成分。

1.8D型肉毒灭鼠剂冻干试验（1）配毒、分与冻干：按5∶1的比例将毒素与1.2选出的保护剂充分混合，每瓶装量为1亿MLD（6 mL）、2亿MLD （12 mL）、4亿MLD（24 mL），置于-15℃冷库中冻结，将冻结好的毒素置于冻干机中，按冻干曲线图进行冻干，冻干时间为24～48 h；（2）无菌检验：以4亿MLD/瓶为例，加水40 mL，即为1 000万MLD/mL毒素，取普通斜面普通肉汤，加生肝块VF 各2支，每支接种0.2 mL，37℃培养7 d，观察有无细菌生长；（3）毒价测定：用体重16～18 g小鼠，静脉注射测定毒价，冻干后毒价有无变化。

1.9残留水分测定将本室生产的D型肉毒冻干剂3批次（200901、201001、201002批），其中200901批供试样品10瓶，201001、201002批供试样品各5瓶，采用真空干燥法，测定残留水分含量。

1.10保存期试验取D型肉毒冻干剂（0801批），毒价为2亿MLD/瓶）24瓶，分别放于37℃温箱及室温中（13℃～18℃），每个月测毒1次，共测12个月，冻干剂用明胶缓冲液稀释，测毒用体重18～22 g小鼠静脉注射，记录测毒结果。

2　结果

2.1D型肉毒灭鼠剂冻干保护剂的选择

2.1.1物理性状冻干后取出，观察不同配方的保护剂冻干后的性状，蔗糖明胶的外观最好，呈棕黄色疏松块状；蔗糖淀粉次之；单用蔗糖有泡状突起；蔗糖奶粉最差。

2.1.2溶解情况加蒸馏水于各样瓶内，观察瞬间溶解情况，根据溶解的快慢及完全与否依次为:蔗糖明胶-蔗糖-蔗糖淀粉-蔗糖奶粉。

2.1.3测毒情况分别取各个配方组1瓶，加10 mL蒸馏水（使每毫升含毒素为1 000万MLD），溶解后取1 mL毒素液用明胶缓冲液进行适当稀释后静脉注射小鼠测含毒量。试验结果见表1。

表1　保护剂试验结果

根据毒素冻干后的性状、溶解性及毒价，确定毒素冻干用保护剂的成分为30%蔗糖+10%明胶，毒价稳定，冻干效果良好。

2.2D型肉毒灭鼠剂冻干试验

2.2.1物理性状为棕褐色，疏松块状。

2.2.2无菌检验以4亿MLD/瓶为例，加水40 mL，即为1 000万MLD/mL毒素，取普通斜面普通肉汤，加生肝块VF各2支，每支接种0.2 mL，37℃培养7 d，无任何细菌生长。

2.2.3毒价测定用16～18 g小鼠，静脉注射测定毒价，冻干后毒价未发生变化。

按上法共冻干4批，生产D型肉毒冻干剂25.152万mL，冻干情况见表2。

表2　D型肉毒冻干剂冻干情况

采用该冻干方法制备D型肉毒毒素冻干剂可行，达到了冻干剂企业标准的要求。

2.3残留水分测定经3批次的残留水分含量测定，D型肉毒冻干剂的平均残留水分含量在

3.45%～4.62%之间，达到了冻干剂企业标准中残留水分含量在5%以内的质量要求。详见表3。

表3　D型肉毒冻干剂中残留水分含量测定

2.4保存期试验D型肉毒冻干剂室温保存10个月毒力未发生变化，11个月后由2亿MLD/瓶降至1亿MLD/瓶，见表4。

表4　D型肉毒冻干剂在室温和37℃的保存期试验结果

37℃保存6个月毒力未发生变化，7个月毒力由2亿MLD/瓶降至1亿MLD/瓶。

2.5D型肉毒毒素冻干剂冻干曲线图通过冻干试验，将隔板温度、冷凝器温度、产品温度及真空度与时间的关系，绘制了冻干曲线图（图1）。

3　讨论

3.1根据D型肉毒毒素冻干后的性状、溶解性及毒价，确定毒素冻干用保护剂的成分为30%蔗糖+ 10%明胶，毒价稳定，冻干效果良好。

3.2采用该冻干方法制备D型肉毒毒素冻干剂可行，冻干毒素物理性状、无菌检验、毒价测定及残留水分含量均符合产品标准。

图1　D型肉毒毒素冻干剂冻干曲线（单位：温度℃，真空度Pa，时间h）

4　结论

4.1研制的D型肉毒毒素冻干剂在室温（13℃～18℃）可保存10个月，37℃可保存6个月，远远超出水剂室温（13℃～18℃）可保存2个月，37℃可保存7 d的保存期，且便于运输、保存和使用。为我国的草原鼠害防治领域增加了一种新的剂型。

4.2采用该方法试生产D型肉毒毒素冻干剂25.152万mL，完成草原鼠害防治200万亩，灭效均在90%以上。通过毒理、安评和药效试验，取得了农药生产许可证和农药临时登记证。

参考文献：

［1］王明俊.兽用生物制品学［M］.北京：中国农业出版社，1997：346-368.

Study on Freeze- dried Agent of Typeof D Botulinum Toxin

LIU Sheng-cai，ZHANG Xi-yun，HU Guo-yuan，FAN Yu-xia，LI Sheng-qing，LI Xiu-ping，WANG Ting-ting，LI Zhi-ning，HUANG Rong，LIU Huai-xin
（Animal Sciences and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining 810016，China）

Abstract：The freeze-dried agent of type of D Botulinum，a new type of D Botulinum Toxin was developed based on the choice of protective agent and freeze-dried test.type D new dosage forms，Botulinum toxin type.30%of sucrose + 10%of gelatin as the protective agent of freeze-dried agent was determined.Under room temperature（13～18℃），it can be stored for 10 months. It can be stored for 6 months in37℃.Moisture content was less than 5%.The freeze-drying curve was made. Key words：Type of D Botulinum toxin；Protective agent；Storage period；Freeze-drying curve

中图分类号：R 378.91

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0113- 03

收稿日期：2014-05-23

作者简介：刘生财（1968-），男，副研究员，本科，从事预防兽医学研究工作，E-mail：Liushc315@163.com