岷当归提取物对血管性认知功能障碍模型大鼠海马Bcl-2与Bax 蛋白表达的影响

东　红　杜改焕　李妍怡　邵　亚　周立文　崔　晓



※为通讯作者

岷当归提取物对血管性认知功能障碍模型大鼠海马Bcl-2与Bax 蛋白表达的影响

东红1※杜改焕1李妍怡1邵亚1周立文1崔晓2

【摘要】目的通过对岷当归的主要有效成分的提取与分离，观察不同岷当归提取物对血管性认知功能障碍模型大鼠神经凋亡细胞Bcl-2和Bax表达的影响，探讨岷当归提取物对模型大鼠神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法采用双侧颈总动脉反复夹闭+单侧颈总动脉结扎的方法制备慢性脑低灌注大鼠血管性认知功能障碍模型。选取雄性wistar大鼠60只，随机分为假手术组(sham-operation group，S)、模型组(model group，M)、尼莫地平对照组(Nimodipine control group，N)、当归挥发油组(Volatile oil from Angelica sinensis group，V)、 当归多糖组(Angelica polysaccharide group，P)、岷当归水煎剂组(Min angelicasinensis water decoction group，X)6 组。除假手术组S组外其余M组、N组、V组、P组、X组各组采用反复夹闭双侧颈总动脉+硝普钠注射+单侧颈总动脉结扎的方法，制备慢性脑低灌注大鼠血管性认知功能障碍模型。S组、M组给予生理盐水灌胃，N组给予尼莫地平灌胃，V组给予当归挥发油灌胃，P组给予当归多糖灌胃，X组给予岷当归水煎剂灌胃，每日1次，连续灌胃治疗4周。灌胃结束后第1天、第4天、第5天进行行为学试验(水迷宫法)。断头处死大鼠，留取脑组织，光镜下观察HE染色病理切片，免疫组织化学方法检测Bcl-2和Bax表达，高清晰彩色病理图文分析系统定量分析。结果Morris水迷宫试验显示：各干预组都有提高学习记忆能力的作用，尤以岷当归水煎剂组记忆力改善明显，优于尼莫地平组、当归多糖组和当归挥发油组(P<0.01)；尼莫地平组、当归多糖组、当归挥发油组与岷当归水煎剂组比较均能促进VCI模型大鼠Bal-2蛋白的表达、抑制VCI模型大鼠bax蛋白的表达(P<0.05)，尤以岷当归水煎剂组效果最佳(P<0.01)。结论当归挥发油、当归多糖、岷当归水煎剂均能降低血管性认知功能障碍模型大鼠脑组织细胞凋亡基因bax的表达，增加具有神经元保护作用的bcl-2基因表达，从而抑制神经细胞凋亡，加速神经功能的恢复，共同发挥脑保护作用，但水煎剂作用更为明显，体现了各种有效成分相互协调的优势。

【关键词】血管性认知功能障碍Bcl-2Bax当归提取物尼莫地平

随着经济水平的加速，全球经济的高速发展，老龄化问题逐渐凸显，伴随着人口老龄化的发展，血管性疾病的发生率愈来愈高，由此导致的认知功能障碍发病率也呈增高的趋势，已成为21世纪严重威胁老年人生存质量的疾病。现代医学研究认为，慢性脑缺血是血管性认知功能障碍(VCI)的重要病理基础[1]，如果早期对VCI进行干预，可明显改善生存质量，避免其发展到痴呆的晚期阶段[2]。随着祖国传统医学的发展，在对中药的不断研究中发现：中药在VCI的预防和治疗方面具有多途径、多靶点、多环节等优点。中药预防和治疗VCI的作用日益受到研究者的重视，并己成为治疗VCI的重要手段。本研究通过双侧颈总动脉反复夹闭+单侧颈总动脉结扎的方法制备慢性脑低灌注大鼠血管性认知功能障碍模型，用岷当归提取物分别进行治疗，观察大鼠学习、记忆能力，免疫组化法检测海马CA1区Bcl-2和Bax的表达，寻找岷当归提取物治疗与神经保护之间的关系，探析其对神经保护的作用机制，为岷当归提取物制剂的市场化提供试验依据及奠定理论依据，为VCI患者找到一种高效廉价的预防和治疗药物。

1.材料与方法

1.1动物SPF级健康雄性wistar大鼠60只，体重200±20g，由甘肃中医学院科研试验动物中心提供，试验动物质量合格证编号：SYXK(甘)2011-0001。

1.2岷当归成分的分离与提取取岷当归药材粉碎后至超临界萃取釜中，在萃取压力25Mpa萃取温度为40℃、解析压力6Mpa、解析温度为50℃，CO2流量为20L/h条件下萃取2小时，收集当归挥发油。取超萃取后的当归药材，置不锈钢锅中煎煮3次，第一次加入6倍水煎90分钟，第二次加入4倍水煎煮60分钟，第三次加入4倍水煎煮40分钟；过滤，合并滤液，加热浓缩成稠膏，放冷，加入95%乙醇配成60%的醇溶液，放置过夜，过滤，分别收集滤液、沉淀物，滤液加热浓缩至无醇味称重，沉淀物稍微风干称重。沉淀物为当归多糖，滤液为黄酮、皂苷。

1.3岷当归水煎剂的制备取岷当归100g，加蒸馏水浸泡30分钟，煮沸2次，每次2小时。合并水煎液，浓缩至水煎液浓度为1g(生药)/ml，4℃保存。

1.4主要试验试剂兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(北京中杉金桥生物科技有限公司)，兔抗大鼠Bax多克隆抗体(北京中杉金桥生物科技有限公司)、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)、兔SP试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)、多聚甲醛(天津科化)、二氧化钛(天津光复精细化工研究所)。Bcl-2(兔抗人多克隆抗体)浓缩型，工作浓度1:150，购自北京中杉生物技术有限公司；Bax(兔抗人多克隆抗体)浓缩型，工作浓度1:100，购自北京中杉生物技术有限公司。

1.5分组及模型制备方法将所有大鼠称重后，按随机数字表法，随机选取8只作为假手术组(S组)，其余大鼠制备慢性脑低灌注大鼠血管性认知功能障碍模型，造模方法采用双侧颈总动脉反复夹闭+单侧颈总动脉结扎法。10%水合氯醛(0.3ml/100g体重)腹腔注射法麻醉后，将试验大鼠仰卧位固定在手术台上，颈部正中切口，剥离组织，暴露颈总动脉和迷走神经，分离迷走神经和颈总动脉，向腹腔内注射硝普钠2.5mg/kg，造成低血压，随后立即用无创微动脉夹，夹闭双侧颈总动脉，10分钟后，放开微动脉夹，10分钟后，再次夹闭，反复3次，之后结扎右侧颈总动脉。假手术组只分离动脉不结扎，不注射硝普钠。手术后适量青霉素抗感染，在完全缝合消毒后，观察状态，术后注意观察伤口情况，常规饲养。动物苏醒后出现眼睑下垂，眼裂变小说明手术成功。造模过程中，1只死于脑水肿，2只死于出血过多，2只死于感染，1只肢体活动障碍，1只未达痴呆标准，1只死于喂养不当。剔除不合格大鼠后再次按随机数字表法随机将大鼠分为模型组(M组)、尼莫地平对照组(N组)、当归挥发油组(V组)、 当归多糖组(P组)、岷当归水煎剂组(X组)5组，每组8只。

1.6灌胃给药大鼠给药剂量按人与大鼠体表面积进行换算。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃，尼莫地平组给予尼莫地平9mg/kg灌胃，当归挥发油组给予当归挥发油提取物75mg/kg 灌胃，当归多糖组给予当归多糖提取物0.1g/kg灌胃，岷当归水煎剂组给予岷当归水煎液1.08g/kg灌胃，每日1次，连续灌胃治疗4周。

1.7试验检测方法及指标

1.7.1行为学测试：采用Morris水迷宫[3]法分别于灌胃结束后第1天、4天、5天对大鼠进行定位航行试验和空间探索试验，并分别进行数据记录。

1.7.2Bcl-2与Bax指标检测：行为学试验结束后，将大鼠脱颈处死，然后取下头颅，并在冰盘上快速取出脑组织，弃去嗅球及小脑，沿矢状线正中切开取脑并进行固定，选择海马区，标本固定后切片，进行HE染色，用免疫组织化学方法检测Bcl-2和Bax的表达，光镜下观察组织病理学改变，采用对Bal-2，Bax平均光密度进行病理图文定量分析。

2.结果

2.1大鼠Morris水迷宫检测试验数据①定位航行试验：分别于给药结束后第1 天和第4天对大鼠的学习成绩与记忆成绩进行测试，结果显示：给药后第1天、4天，M组、N组、P组、V组、X组各组与 S组相比，游全程时间延长，差异具有显著性统计学意义(P<0.01)；与 M组比较，给药结束后第1天，N组、V组无显著性统计学意义(P>0.05)，P组、X组有显著性统计学意义(P<0.05，P<0.01)。给药结束后4天，N组、P组、V组、X各组与 M 组比较，游全程时间延长，差异有显著性统计学意义(P<0.01)。②空间搜索试验 给药结束后第5天，M 组大鼠的反应时间延长，撤除平台后跨越原平台次数明显减少，与 S 组比较，有显著性统计学意义(P<0.01)。X组与M组比较，反应时间有所缩短，在撤除平台后，大鼠跨越原平台的次数明显增加，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；X组与N组、P组、V组各组比较,跨越原平台次数明显多于其他各组，差异有显著性统计学意义(P<0.05或P<0.01)；M组、N组、P组、V组各组之间比较无显著性统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1　逃避潜伏期时间和通过原平台位置次数比较±s)

注：与假手术组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，△P<0.05，▲P<0.01，▽P>0.05。

2.2IPP图像分析系统定量分析M组大鼠Bal-2，Bax平均光密度，与 S 组比较差异具有显著性统计学意义(P<0.01)。Bal-2平均光密度，N组、P组、X组各组与 M 组比较，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)；Bax平均光密度值增高,N组、P组、X组各组与 M 组比较，差异有显著性统计学意义(P<0.01)，X组Bal-2平均光密度较模型组显著增加，Bax平均光密度较模型组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2　Bcl-2和Bax平均光密度比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，△P<0.05，▲P<0.01，▽P>0.05。

2.3病理组织学观察

2.3.1HE染色切片观察：与假手术组相比，模型组神经细胞排列出现紊乱，细胞界限不清晰，结构欠清晰。细胞形态不规则，树突减少。细胞周围间隙增宽。核浆比例增加，核大，染色深，染色质粗大，多见核内空泡，间质水肿明显，胶质细胞明显增生。尼莫地平组结构欠清晰，排列轻度紊乱，细胞数量相对减少，核大，核浆比例增加，可见核内空泡。间质内可见胶质细胞增生。当归多糖组细胞结构较清晰，排列轻度紊乱，细胞数量相对减少，可见核内空泡。间质内可见胶质细胞增生。当归挥发油组细胞结构清晰，排列较整齐，核浆比例正常，染色细腻，细胞数量相对减少，间质内可见胶质细胞增生。岷当归水煎剂组大多数细胞排列整齐，细胞数目减少，胶质细胞增生。结果见图1。

注：S组：假手术组，M组：模型组，N组：尼莫地平组，P组：当归多糖组，V组：当归挥发油组，X组：岷当归水煎剂组 (海马 HE×40)。图1

2.3.2免疫组化染色观察：Bcl-2蛋白主要表达于神经细胞的胞浆和细胞膜，DAB显色呈棕黄色者即为阳性细胞。假手术组有少量表达,模型组表达明显增加(P<0.05)。与模型组比较, 尼莫地平组、当归多糖组、当归挥发油组和岷当归水煎剂组Bcl-2表达显著增加，且岷当归水煎剂更优于其他组(P<0.05)。 Bax蛋白分布在神经细胞的胞浆、突起和核膜上，DAB显色呈棕黄色着色为阳性细胞。假手术组仅有少量表达，模型组表达显著增多(P<0.05)。与模型组比较, 尼莫地平组、当归多糖组、当归挥发油组和岷当归水煎剂组Bax表达显著降低，且岷当归水煎剂组低于其他组(P<0.05)。结果见图2、图3。

3.讨论

血管性认知功能障碍(VCI)是由脑部血管疾病所导致的一类精神障碍类疾病，已成为21世纪严重威胁老年人生存质量的疾病。目前，对VCI的认识还很不足，对其病因、发病机制、药物治疗及预后仍未阐明，多数学者认为脑部血氧不足可以引起大脑神经元和脑白质神经纤维的损害，受到损害的脑部组织由胶质细胞替代进而逐渐出现认知功能障碍[4]，相关研究认为基底节、丘脑等重要部位梗死或出血导致认知障碍的概率明显增加，且许多高级智能活动中枢主要存在左侧大脑半球，其损伤病变导致认知障碍较右半球严重[5]。另外，反复短暂性脑缺血发作(TIA)不但会引起认知障碍，还会导致脑梗死，在认知和记忆障碍上TIA的诱发率分别为23%和54%[6]。现代医学研究认为，细胞的自然死亡是在受到内外环境的刺激下，启动控制细胞死亡的基因点，而由脑部缺血因素引起的梗死灶和神经功能损伤在这一过程中起着负面影响。Bcl-2所包含的基因家族在细胞的凋落死亡过程中发挥着重要作用，主要表现在由它们的表达所生成的产物促使细胞的成活，而Bax则加速了所起作用的细胞凋落死亡[7]。袁敏[8]等通过研究显示，血管性痴呆的大鼠海马CA1区不同时间点自噬相关蛋白Beclin-1表达数与凋亡相关蛋白Bcl-2表达数呈正相关，表明了血管性痴呆大鼠海马CA1区细胞自噬和凋亡同时发生，且表达趋势一致，提示细胞凋亡参与了血管性痴呆的发病过程。如果早期对VCI进行干预，可明显改善生存质量，避免其发展到痴呆的晚期阶段[2]。

注：S组：假手术组，M组：模型组，N组：尼莫地平组，P组：当归多糖组，V组：当归挥发油组，X组：岷当归水煎剂组(免疫组化×40)。图2　各组大鼠海马Bcl-2表达比较

注：S组：假手术组，M组：模型组，N组：尼莫地平组，P组：当归多糖组，V组：当归挥发油组，X组：岷当归水煎剂组(免疫组化×40)。图3　各组大鼠海马Bax表达比较

目前临床上的治疗药物主要是胆碱酯酶抑制剂、改善脑部血流循环、脑部细胞激活剂、神经细胞保护剂以及雌激素代替疗法等。这些药物虽有一定的疗效但是存在缺点颇多，如疗效不稳定，药品价格昂贵等这些弊端，患者多不能长期坚持服用，这大大影响了临床的预后，因此，如何选择更加经济且疗效显著的药物成为现代医学研究的一大热点。随着祖国传统医学的发展，在对中药的不断研究中发现：中药在VCI的预防和治疗方面具有多途径、多靶点、多环节等优点。中药预防和治疗VCI的作用日益受到研究者的重视，并己成为防治VCI的重要手段。

中药治疗方面主要通过补肾、活血、祛痰等方法，大大改善神经递质传导，改善微循环，改善自由基代谢，抗细胞凋亡，调节基因表达的作用，在防治血管性痴呆的过程中起到了重要的作用。如：胡玉英[9]选用交泰丸，通过交通心肾来治疗痴呆，发现交泰丸可降低VD大鼠脑MAO活性，提高NE，DA，5-HT 含量；王鹏[10]通过试验得出：银杏叶提取物可增加海马中生长抑素(SS)和胆囊收缩素(CCK)的表达，在一定程度上改善VD小鼠的学习记忆能力；王莹[11]指出红景天苷能够减轻反复脑缺血再灌注所致的神经细胞层次不凊，突触减少，核固缩等病理改变，从而达到改善血管性痴呆小鼠学习记忆能力的作用。徐新利[12]在对岷当归水煎液对小鼠缺氧的试验中发现，其水煎液可以使小鼠在非正常条件下的游泳和存活时间延长，也就是在缺氧的情况下，与模型组比较差异显著(P<0.01)，验证了岷当归水煎液对疲劳和缺氧有良好的治疗作用。李氏[13]通过试验表明，对大鼠脑部血流缺失的再灌注可以使损伤的神经起到保护作用。

本试验结果显示各干预组都有提高学习记忆能力的作用，且可明显减少VCI大鼠细胞凋亡的趋势，促进VCI模型大鼠Bal-2蛋白的表达，抑制VCI模型大鼠Bax蛋白的表达，起到保护神经元的缺血、保护神经细胞的作用，其机理可能是抑制细胞的凋落死亡。另外，岷当归水煎剂组与尼莫地平组、当归多糖组、当归挥发油组相比(P<0.01)，验证了中药水煎剂组中各个有效成分的协调作用优于有效成分组，体现了传统医药的优势，临床使用更为便利。

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11王莹,刘玉刚,陈占法.红景天苷对血管性痴呆小鼠学习记忆行为的影响[J].河北医药,2013,35(16):2416-2418.

12徐新利.岷当归抗疲劳及缺氧的研究[J].甘肃中医,1999,12(4):50-51.

13李成山,刘超,李妍怡.大剂量岷当归对大鼠脑缺血再灌注损伤MPO表达的影响[J].湖南中医杂志,2013，29(4):118-119.

作者单位：1.甘肃省中医院7300502.甘肃中医学院730000

作者简介：东红，女，本科，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：中西医结合脑血管病防治。

基金项目：甘肃省自然科学研究基金(1107RJZA224)

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.02.007

收稿日期：2016-3-10