儿童专科医院特色生物样本库的建立与应用

王敏，高志梅，吕志宝，陈方，周君梅



儿童专科医院特色生物样本库的建立与应用

王敏，高志梅，吕志宝，陈方，周君梅

作者单位：200040 上海交通大学附属儿童医院中心实验室（王敏）；200040 上海市儿童医院中心实验室（高志梅、吕志宝、陈方、周君梅）

生物样本库是一种集中收集、处理、存储和应用各种生物材料及其相关信息用于疾病的临床诊疗研究的生物应用系统［1］。一般由两部分组成：一是样本实体库，即可以从中提取到 DNA、RNA、蛋白质等成分的组织或血液等生物样本；二是样本信息库，包括从生物样本中提取 DNA、RNA、蛋白质等成分所得到的个人独有的遗传信息数据及临床诊疗信息［2］。

早在 1994 年，中国科学院就建立了中华民族永生细胞库［3］，随着转化医学受到越来越多的重视，国内生物样本库建设也渐趋升温［4-5］。2003 年，我国启动了“国家自然科技资源共享平台建设”项目，科学技术部在《“十二五”生物技术发展规划》中明确指出，要“建设若干资源共享的重大科技基础设施”，包括“大型生物样本、标本、病例资源和人类遗传资源库以及共享服务体系”［6］。

上海市儿童医院拥有丰富的儿童疾病资源，在上海交通大学医学院“985 工程”三期样本库项目和上海市科委样本库重大项目的资助下，为了整合各临床科室分散收集和存储的疾病样本，于 2012 年初开始筹建面对全院临床科室的儿科疾病的生物样本库，同时开始培养专职工作人员，建立全院统一的标准化管理制度和技术规范［7］，目的在于科学采集、处理和存储儿科疾病样本资源，为相关疾病的基础和临床研究提供材料。以儿童肿瘤、出生缺陷和遗传代谢性疾病为特色的儿童专科医院生物样本库已初步建成，标准化、规范化的样本采集、存储和管理体系也已经建立。

1　系统和流程

1.1软件系统

1.1.1规章制度与专职团队我院生物样本库在参考国际及国内其他生物样本库相关标准制度的前提下，结合本院自身特点，在学术委员会和伦理委员会的指导下，成立了样本库管理中心（图1），制定了一系列管理制度，包括样本库标准操作规程、人员培训管理、临床沟通管理等。样本库的标准操作规程严格规定了从样本库的规划建设到样本出入库过程的每一个环节，使之有章可循、有据可考。人员培训管理和临床沟通管理旨在贯彻落实样本库专人负责，专职人员定期接受针对性的专业培训，提升其对样本库的管理能力。

图1　我院生物样本库管理框架及工作流程

1.1.2信息系统样本的信息包括样本本身所含遗传信息及其所对应的捐献者的相关临床诊疗信息。我院生物样本库应用上海交通大学医学院统一的生物样本库信息管理系统，对出入库的样本进行信息化管理，实现在库样本的实时统计与查询和样本信息的实时自动化备份；同时，我院样本库信息系统与我院的临床数据库初步对接，进一步促进样本临床信息管理的规范化、网络化，其目的是使信息的查询更加快速便捷、提高生物样本库的使用效率；在数据安全性方面，该信息系统能够定义使用权限设置与系统登录自动化记录，保证生物样本信息的安全及隐私［8］。

1.2硬件系统

我院生物样本库设有专属场地，冰箱、空调均配备双电路系统并独立配电，保证用电设备的正常运行、环境温度的可控。按照功能，生物样本库分为样本接收区、样本处理和质控区、样本存储区和信息管理区等区域（图2）。

选择第三方认证的绿色债券逐渐增多，第三方认证机构中安永业务排名领先。从认证只数看，第三方认证的债券只数同比上涨89.18%，安永认证只数位列第一，2017年新加入的第三方认证机构包括毕马威、普华永道、中诚信等；从认证金额看，安永依然位列第一。绿色企业债由发改委审核，不要求进行第三方认证，故剔除绿色企业债后，第三方认证债券数量占比达到85.2%，认证金额占比达到81.52%。总体来看，第三方认证的绿色债券数量稳中有升，绿色债券市场越发规范，市场透明度逐步提高。

1.2.1样本接收区该区域用于放置样本交接所需的各类文件材料，包括含有样本基本信息及采集者、接收者签字的样本登记表，临床标本运送信息卡以及患儿家属签字的知情同意书等。

1.2.2样本处理和质控区该区域配备有 DNA 自动化抽提仪、低温高速离心机用于样本的处理和分装；条码打印机配备相应冷冻条码标签于样本入库前打印以清晰标记每份样本；激光条码扫描枪用于样本入库时扫描冻存管上粘贴的二维码以确保样本位置的准确性。另有质量控制相关设备，包括红外/紫外分光光度计用于核酸浓度及纯度的测定，多功能酶标仪测定蛋白浓度，实时荧光定量 PCR 系统检测基因表达，以及可进行各类凝胶电泳的通用电泳仪和化学发光成像系统。

1.2.3样本存储区该区域配备有 4 ℃ 冰箱、-20 ℃ 冰箱、-80 ℃ 超低温冰箱、-150 ℃ 卧式超低温冰箱以及液氮存储罐，可满足不同类型的样本在不同温度下的存储要求。冰箱内部空间合理规划，根据疾病和样本类型为各临床科室预留样本存储空间，并在样本信息管理系统中的样本存储设置中同步规划。样本接收登记后，按照信息系统中所提供的位置有序摆放。样本存储室及冰箱配备冷链温度监控系统，可实时监测样本存储室及冰箱的温度，且该系统与样本库管理人员通讯设备连接，可将室内及冰箱内部温度变化发送给管理人员，实现远程实时监控，帮助管理人员对突发事故做出及时应对。

1.2.4信息管理区该区域配备生物样本库信息管理系统服务器及专用计算机、冷链温度监控系统专用计算机，保证各设备的正常运行，并可在该区进行样本的出入库管理、查询等操作。样本库的各项文件资料包括管理制度和操作流程等也保存于该区域。

1.2.5库房除了以上功能区域，样本库还设有专用库房，用于存放样本处理过程中所用到的各种实验耗材，包括冻存盒、血液冻存管、组织液氮冻存管等；以及各种试剂，包括用于保护组织中 RNA 稳定性的 RNA later、DNA 自动化抽提仪配套试剂盒等。

1.3样本出入库流程

1.3.1样本采集前的准备样本采集方案经伦理委员会审查批准后实施。样本采集前由临床医师与患儿家属沟通，解释说明样本采集的意义、方法以及对样本捐赠者可能造成的影响，与患儿家属签订知情同意书。另外我院特别制定了“一病一卡”管理制度［7］，保证样本采集和运输的科学性、规范性，从源头上保证样本质量。

1.3.2样本采集伦理委员会审查批准并获得患儿家属知情同意书后，由临床工作人员严格按照相关采集流程合理规范采集所需样本，于容器表面注明样本基本信息，填写样本登记表、临床标本运送信息卡以及知情同意书等材料。

1.3.3样本接收与入库临床工作人员将样本及相关材料与样本库管理人员交接后由后者对样本进行处理并入库。为避免样本使用时反复冻融影响样本质量，收到的样本被分装成小份冻存，冻存管外粘贴带有唯一二维码的条码标签，放入冻存盒后按照信息系统生成的冰箱位置进行存储；存储过程中，由样本库两名工作人员共同进行样本信息及存储位置信息的核对和确认，保证信息的正确导入。

图2　生物样本库布局示意图

1.3.5样本出库使用者需递交申请单，经学术委员会和伦理委员会审核批准后方可由样本库管理人员从信息系统中查询所需样本位置然后将其正确取出；样本出库过程由样本库两名工作人员共同现场核对与确认，并在样本出库后，于信息管理系统中完成出库登记及库存的及时更新。

2　取得的成绩

自 2012 年年初至今，在上海交通大学医学院“985 工程”三期样本库项目和上海市科委样本库重大项目的资助下，我院建立了样本库管理体系，培养了专职的样本库管理团队，完善配备了专业的样本库场地与设备，通过整合与新建并举，原先各临床科室分散存储的样本得到了统一规范管理，同时与各临床科室联合收集了多个病种的疾病样本，已初步建成了以儿童肿瘤、出生缺陷和遗传代谢性疾病为特色的儿童专科医院生物样本库，并已开始支持科研课题的立项和开展。

样本库所在场地合理规划布局，硬件设施配备齐全，样本接收、处理、存储、质控和信息等各个功能区域独立划分、功能明确；信息系统已较为完善，可为各临床科室提供便捷的样本管理，通过权限设置保证了信息的安全性；管理人员严格按照所制定的各项规章制度规范化操作，已基本形成了标准化、规范化的样本采集、存储和管理体系。

2.1入库样本稳步增长，质量达标

在软硬件设施完善的基础上，目前样本库收录了多个临床科室的以儿童肿瘤、遗传代谢和出生缺陷为特色病种的疾病样本。自样本库建设之初至 2013 年第一季度仅收集了6 个病种的不足 300 份样本；至 2014 年初，样本库飞速发展，入库病种数超过 20 种、样本量突破 10 000 份；至今，入库病种数已基本稳定，入库样本量保持持续稳步上升的状态，现已库存 25 个病种 20 000 余份样本（图3）。

图3　生物样本库库存样本总数及病种数统计

图4　琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性（M：分子量标准；1 ～ 10：外周血中抽提的 DNA）

在保证入库病种和样本数量的基础上，样本库对入库样本开展质控检测，抽提的核酸纯度较高，A260/A280、A260/A230 均在 1.8 以上，凝胶电泳 DNA 条带完整（图4），RNA28S/18S 条带比值在 1.3 ～ 1.8 之间，核酸完整性好，无明显降解，且后续 PCR 扩增能力正常；Western blot 条带显示蛋白未发生降解。

2.2入库样本支持的科研成效

首先，生物样本库支持了各级别科研课题的立项，分别来自国家自然科学基金、上海市科委、上海市教委、上海市卫生计生委、上海交通大学医学院等。以国家自然科学基金为例，近 3 年生物样本库共支持了 15 项国家自然科学基金项目的立项，约占同时期本单位国家自然科学基金立项总数的 75%。涉及的病种包括遗传性肾炎、隐睾、自闭症、先天性髋关节脱位、先天性巨结肠、先天性胆道闭锁、神经母细胞瘤、川崎病、性发育不良等。这些课题将针对特定疾病的临床早期预警及相关基因突变、早期诊断的生物学标记物、个体化治疗等开展研究。在此基础上，本样本库已被纳入上海市重大疾病临床生物样本实体库专业技术服务平台。

其次，利用生物样本库的样本开展的研究已经发表多篇论著，其内容涉及样本库的规范管理［7， 9］，以及先天性巨结肠［10］、神经母细胞瘤［11-12］等疾病相关的临床研究。

3　小结

作为一家三级甲等儿童专科医院，上海市儿童医院拥有丰富的儿科临床疾病资源，这些宝贵的资源若能得到合理采集和存储，继而用于转化医学研究，将为儿科疾病的诊疗带来新方法。经过多方调研和学习，我院于 2012 年初开始筹建面向全院临床科室的儿科疾病生物样本库，同时参照国内外样本库建设标准，结合自身特色，建立了较为完善的样本库标准化管理制度和技术规范，在之后的实际运行中不断发现并解决问题、改进和完善工作流程，目前已取得良好的成果。以儿童肿瘤、出生缺陷和遗传代谢性疾病为特色的生物样本库已基本建成，可为相关疾病的基础和临床研究提供疾病样本。样本库支持的各级科研课题的立项和论著的发表，也标志着我院样本库从建设阶段向产出阶段的转换。

样本库建立之初，由于经验不足，相关制度不完善，遇到各种问题，主要涉及样本的规范化采集和运输、与临床医师的沟通、样本的质量控制等方面。经过专职管理人员的努力，遇到的问题都得到了较好的解决，这些经验教训可供初建样本库的医院借鉴。

3.1样本采集过程遇到的问题与解决方法

我院生物样本库建立之初工作进展缓慢，入库的疾病病种及样本数量未有明显增长。考虑有以下原因：①生物样本库作为本院一项新开展的工作还不被大多数工作繁忙的临床医师所了解和理解，对加入其中尚有顾虑；②各科室各病种原有的样本采集及运输等流程不统一，操作复杂，一方面导致样本库人员工作量加大，难以负荷更多的样本量，另一方面临床医师对样本的标准化采集不了解，尤其是对基于尚未立项的疾病样本的采集缺乏战略眼光和全面布局，双方的因素同时限制了样本库工作面向全院的推广。

从保证样本质量的目的出发，针对以上问题，我院样本库工作人员通过组织培训、与临床医师交流沟通等方式，在全院范围内大力宣传生物样本库建设的深远意义，并积极与临床医师合作，根据每个病种的特点和科研需求研究制定了该病种对应的《临床运送标本信息卡》［7］。此卡片涵盖了每个病种需要采集的样本类型、数量、采集方式及与之匹配的运输条件、保存方式等，临床医师只需填写患者基本信息（姓名、住院号），然后按照实际采集的样本对以上各项进行勾选即可，即“一病一卡”，操作简捷。此项制度具有以下优点：①保证了生物样本采集和运输过程的规范化和标准化，保证了该病种未来研究所需的样本的种类和数量均能满足需求，从源头上保证了样本质量；②保证了样本采集和运输过程的科学性和条理性，提高工作效率；③大大减少了临床医师的工作量，有助于调动其采集样本的积极性；④信息卡片上的患者信息为将来样本信息与临床资料信息的联网、整合样本实体库和临床资料库提供了充足的条件。自“一病一卡”制度应用以来，样本库的入库病种数快速增加，逐渐稳定后，入库的样本数仍维持着稳定的增长态势。

3.2样本质量的保证

样本质量是整个样本库的核心［13］，高质量的样本对于深入研究疾病以完善诊疗非常关键［14］，而科学研究所得到的数据是否可靠则有赖于样本在采集、处理及存储等各阶段严格的质量控制［15］。因此，我们在保证样本质量方面做了大量工作：①从样本采集的源头进行质量控制：分析前变量的控制是实现实验结果一致性及可重复性的重要因素之一［16］，我院生物样本库通过“临床运送标本信息卡”制度的实施，实现了样本的采集过程、采集形式、信息留取、目标形式等方面的规范，从源头上保证了样本的质量；②样本处理及存储中的质量控制：为了保证所有生物样本库相关课题都能得到有意义的结果，我院生物样本库参考了国内外相关标准制度并结合本院自身特点，制订了严格可行的操作流程以及完善的质量控制体系，核酸的抽提和质控由专人负责、保证了样本处理规范，同时，专职人员定期接受样本库相关培训，提高样本库管理能力。通过定期随机抽检在库样本，实现了对在库样本质量变化的监测，冷链温度监控系统、标准的存储空间及设施等保证了样本存储环境的正常状态。

3.3生物样本的利用

利用生物样本进行生命科学研究、进而服务于临床诊疗是生物样本库建设的最终目的［17-18］，只存储而不利用生物样本是对社会资源的浪费。我院生物样本库在近 3 年多的建设和运行过程中，采集和存储的样本以儿童肿瘤、出生缺陷和遗传代谢性疾病为特色，迄今已经支持了涉及多病种的多项国家和省市级课题的立项，其研究结果已经开始支持相关论著的发表，标志着我院的生物样本库已经从建设阶段转换到产出阶段，未来必将服务于更多的科研课题，同时吸引更多合作者利用我院生物样本库进行转化医学研究、增加产出，使其存在更有价值。

我院生物样本库在取得现有成绩的基础上正努力完善，现有的样本信息系统只是实现了与临床资料的初步对接，未来的工作重点是将样本信息系统与患者的临床信息、随访信息等深度整合、提升整合后系统的访问效率［19］，使我院生物样本库真正成为样本收集完备、临床资料齐全、随访资料完整的精品生物样本库，更加全面、便利地为多学科的科研及各项人才计划等项目提供宝贵资源，提升生物样本库对医院学科和人才的支撑作用。

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·讲座·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.017

基金项目：上海市卫生计生委重点科研课题（201540389）；上海市重大疾病临床生物样本实体库专业技术服务平台（15DZ2292100）；上海交通大学医学院“985 工程”三期样本库项目（YBKL2013008）

通信作者：周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

收稿日期：2016-01-28