埃博拉病毒进入抑制剂筛选模型的建立与应用

王静，陈淑敏，马铃，张瑞欣，李卓荣，余利岩，岑山



埃博拉病毒进入抑制剂筛选模型的建立与应用

王静，陈淑敏，马铃，张瑞欣，李卓荣，余利岩，岑山

【摘要】

目的旨在以埃博拉病毒（EBOV）包膜糖蛋白（GP）为靶点，建立埃博拉病毒进入抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选具有特异性抑制埃博拉病毒进入的活性样品。

方法利用细胞水平重组病毒技术，分别用两株不同爆发时间的 Zaire-EBOV 的 GP 与 HIV 核心质粒（pNL4-3.Luc）共表达，制备重组病毒 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和EBOV-GP-New/HIV-luc。利用 ELISA 和荧光素酶检测技术，优化病毒产量、感染性、感染剂量及荧光活性测定时间等因素，建立药物筛选模型。利用统计学参数及阳性化合物评估该模型的稳定性和灵敏性。应用该模型，对 242 个样品进行初步筛选，并通过与水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包装的重组病毒 VSVG/HIV-luc 进行比较，以判断样品的特异性。

结果该模型可用于靶向 GP 蛋白的埃博拉病毒进入抑制剂的高通量筛选，并获得 4 种具有特异性抗埃博拉进入活性的样品。

结论该模型可用于抗 EBOV 进入药物的高通量筛选，应用该模型获得的阳性样品有助于抗 EBOV 药物的发现。

【关键词】埃博拉病毒；高通量筛选分析；进入抑制剂

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):193-199

作者单位：100050 北京，中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室

据世界卫生组织报道，2014 年 3 月由扎伊尔埃博拉病毒（Zaire-EBOV）引起的西非疫情是自1976 年首次发现埃博拉病毒以来发生的最大一轮埃博拉疫情。埃博拉病毒为单股负链 RNA 病毒，属于丝状病毒科（Filoviridae）。人感染埃博拉病毒后，主要临床表现为急性发热、肌肉酸痛、头痛、呕吐及肝脏、肾脏受损或有出血等症状［1］。其中扎伊尔型埃博拉病毒致病力最强，且致死率高达90%［2］。迄今还没有被 FDA 批准的疫苗和药物来预防和治疗埃博拉病毒。因此，寻找新的抗埃博拉病毒药物至关重要。由于 EBOV 的高致病性和致死率，对有感染性的埃博拉病毒的研究就只能限定生物安全级别最高的 BSL-4 级实验室中进行，使得依赖于野生型 EBOV 的药物筛选难以实现［3］。

随着基于微型基因组（minigenome）的复制子及复制缺陷的假病毒报告系统迅速发展，抗病毒化合物的快速筛选得以在生物安全 BSL-2 级实验室中进行［4-5］。病毒的细胞进入阶段是病毒复制周期中的重要时期，在病毒感染早期抑制病毒的进入可以减少病毒感染的几率，同时也可降低药物耐药性的发生。因此，病毒的进入阶段成为筛选抗病毒药物的重要靶点。EBOV 基因组长 18.9 kb，编码七种病毒蛋白，其中 EBOV-GP 是唯一负责病毒进入宿主细胞的蛋白。尽管以 EBOV-GP 蛋白为靶点的抗埃博拉病毒进入药物筛选模型已有报道，但均以此前的流行株为基础。2014 年埃博拉病毒的大规模爆发表明病毒的遗传变异改变了其传播和致病能力。根据蛋白序列比对，1976 年经典株与 2014 年流行株的 EBOV-GP 蛋白有 19 个氨基酸位点发生了突变。因此，为了提高研发药物的针对性，本文将分别以埃博拉病毒经典株和流行株的表面包膜糖蛋白为外膜蛋白包裹 HIV 核心制备复制缺陷型假病毒 HIV/EBOV-GP，通过荧光报告基因检测技术来判断样品的抗病毒活性，从而建立以EBOV-GP 蛋白为靶点的病毒进入抑制剂高通量筛选模型，并期望应用该模型获得特异性好的埃博拉病毒进入抑制剂。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品格尔德霉素及其衍生物样品由本所合成室提供；大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物和天然产物样品由本所药用微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2细胞和质粒293T 细胞为本实验室自有；Zaire-EBOV 包膜糖蛋白GP 基因 EBOV-GP-New （GIN/2014/Gueckedou-C07）由苏州金唯智生物科技有限公司合成；EBOV-GP（COD/1976/Yambuku-Mayinga）由加拿大 McGill 大学 Chen Liang 教授惠赠，后由本实验室克隆改造为 EBOV-GP-Old；携带荧光素酶报告基因的 HIV-luc 质粒（pNL4-3.Luc.E¯）和水泡性口膜炎病毒外壳糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G）质粒为本实验室保存。

1.1.3试剂和仪器DMEM、含 EDTA 的 0.25%胰酶、FBS 和 DNA 转染试剂 Lipofectamine 2000购自美国 Invitrogen 公司；荧光素酶活性测定试剂盒及细胞裂解液购自美国 Promega 公司；人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）购自北京万泰生物药业股份有限公司；兔抗 FLAG标签抗体购自美国 Sigma 公司；鼠抗 β-actin 抗体购自英国 Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；Centro XS3LB 960 型酶标仪为德国 Berthold 公司产品；680 型microplate reader 酶标仪、PowerPacTMHC Power Supply 蛋白电泳仪、Mini Trans-Blot 蛋白转膜仪及Gel DocTMXR+凝胶成像仪均为美国 Bio-Rad 公司产品。

1.2方法

1.2.1埃博拉病毒 GP 蛋白的表达检测根据Lipofectamine 2000 转染试剂说明书分别将EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 与 pNL4-3.Luc.E¯质粒共转染至 293T 细胞，同时将转染空载体pcDNA3.1（+） 与 pNL4-3.Luc.E¯质粒的 293T 细胞作为阴性对照。培养 48 h 后 RIPA 裂解细胞，冰置 30 min 后于 4 ℃、13 000 r/min 离心 10 min，收集上清液，按常规 Western blot 方法检测 GP 蛋白的表达，以内源 β-actin 蛋白表达为内参对照。

1.2.2假型病毒产量及感染性测定将细胞按 2 × 105/ml 浓度铺六孔板，24 h 后将 300 ng pNL-Luc-E¯和不同剂量（100、200、400、800、1600 ng）的EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 质粒共转染293T 细胞。48 h 后收取上清病毒液，0.45 μm 滤膜过滤。取部分病毒液按照人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒说明书进行病毒产量的测定。

将病毒液按不同稀释比感染已铺于 96 孔板中的 293T 细胞（细胞浓度为 2 × 105/ml），放入细胞培养温箱中培养。48 h 后吸去上清液，加入 100 μl 的 1 × 细胞裂解液于 37 ℃ 裂解细胞。30 min 后吸取 10 μl 细胞裂解液与 40 μl 荧光素酶底物溶液混匀，利用酶标仪测定荧光素酶活性。

1.2.3高通量筛选流程及模型评价按 2 × 105/ml 接种 293T 细胞至 96 孔板中，培养 24 h后，将样品与 293T 细胞于 37 ℃ 细胞培养箱预孵育 1 h 后加入病毒液，以溶剂 DMSO 为空白对照，每组设立三个平行对照。细胞培养 48 h 后测定细胞荧光素酶活性，并计算样品对病毒的抑制率。为了对本筛选模型的稳定性以及本模型是否适合高通量筛选进行判断，按照生物技术高通量筛选模型通用的统计学原理的方法来计算 Z' 因子和变异系数（%CV）［6］。

1.2.4阳性化合物量效关系的确定按照上述相同方法，用不同浓度的阳性化合物粉防己碱（0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、2、4 μmol/L）处理细胞，并以溶剂 DMSO 作为对照组，每组设立三个平行对照，通过测定荧光素酶活性计算阳性化合物半数抑制浓度（IC50）。

1.2.5样品初筛及活性样品特异性分析初筛样品（格尔德霉素及其衍生物的作用浓度为 20 μmol/L，大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物的作用浓度为 1 mg/ml 和 10 μmol/L，天然产物的作用浓度为 15 μmol/L 或 10 μg/ml）的病毒抑制率通过上述高通量筛选流程及荧光素酶测定方法获得。选取活性样品，比较在 HIV-luc/EBOV-GP 与模型对照组 HIV-luc/VSVG 中的检测结果，进行样品特异性评价。

2　结果

2.1扎伊尔型埃博拉重组病毒感染性分析方法测试

2.1.1编码 EBOV-GP-New 和 EBOV-GP-Old基因的质粒构建根据文献［7］报道，在 NCBI 中查找扎伊尔型埃博拉病毒流行株的基因组序列（Genbank KJ660347，2031 bp），利用基因合成技术，成功将带 FLAG 标签的 GP 基因克隆至真核表达载体 pcDNA3.1（+） 中，命名为 EBOV-GP-New。同时将本室现有的 GP 质粒（RefSeq NC_002549.1，2031 bp）亚克隆至 pcDNA3.1（+） 载体中，命名为EBOV-GP-Old。上述两种质粒经测序鉴定序列正确，构建示意图如图1A 所示。

图1　Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染性测试［A：Zaire-EBOV 的 GP 基因示意图；B：Zaire-EBOV GP 蛋白表达鉴定（1：EBOV-GP-Old；2：EBOV-GP-New；3：pcDNA3.1（+））；C：Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染后的荧光素酶活性测定（1：pcDNA3.1（+）；2：EBOV-GP-Old；3：EBOV-GP-New）］Figure 1　Test of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirions infectivity ［A： Schematic representation of Zaire-EBOV GP genes； B：Identification of Zaire-EBOV GP expression （1： EBOV-GP-Old； 2： EBOV-GP-New； 3： pcDNA3.1（+））； C： Luciferase activity was determined 48 h post-infection （1： pcDNA3.1（+）； 2： EBOV-GP-Old； 3： EBOV-GP-New）］

图2　GP 蛋白对 Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒的产量及感染性的影响（A：Western blot 检测 GP 蛋白的表达情况；B：ELISA 技术检测 GP 蛋白对病毒产量的影响；C：通过等量假病毒感染 293T 细胞后测定荧光素酶活性来检测 GP 蛋白对病毒感染性的影响）Figure 2　Effect of GP expression on the production and infectivity of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirus （A： The expression of GP and β-actin were detected by Western blot； B： The pseudoviral supernatants were used to determined the p24 level by ELISA kit；C： Equal amounts of pseudovirus were infected 293T cells and 48 h later， luciferase activity was determined）

2.1.2GP 蛋白的表达鉴定及 Luc 活性检测在293T 细胞中共表达pNL4-3.Luc.E¯与EBOV-GP-Old 或 EBOV-GP-New，利用 Western blot 实验检测 GP 的表达情况，同时收获病毒上清，感染 293T 细胞，48 h 后测定细胞裂解液的荧光素酶活性。结果表明，EBOV-GP-Old 或EBOV-GP-New 都能够正确表达，且表达水平接近（图1B）。在感染细胞中，两者均可显著提高荧光素酶活性，远高于对照组（图1C）。这说明 GP 能与 pNL4-3 共转后包装成具有感染性的假病毒。

2.2产毒条件优化

为了优化 Zaire-EBOV GP/HIV-luc 的产毒条件，我们研究了不同剂量 GP 蛋白表达质粒与病毒产量和感染性的关系，以确定 GP 包膜质粒与核心质粒间的最佳转染比例。结果显示，随着 GP 质粒转染量的增加，细胞中 GP 蛋白的含量也随之增加（图2A）。当 EBOV-GP-Old 和 EBOV-GP-New转染量分别为 0.2 和 0.1 μg 时，p24 含量最高（图2B），这两种剂量下测定的荧光素酶活性也较强，但相差不大（图2C）。综合分析病毒产量及其感染性两因素后，我们统一将 GP 与 pNL4-3.Luc 质粒转染量比例定于 2∶3，用于后续实验中。

2.3高通量筛选模型的建立

为了优化高通量筛选模型中的各个条件，我们进一步研究病毒感染量及荧光测定时间点对最终荧光值的影响。将病毒液以不同比例稀释并感染细胞，分别于 24、48 及 72 h 时检测细胞荧光素酶活性。结果显示，感染后 48 和 72 h 时荧光值较高，且随着病毒稀释比例的增加，荧光值逐渐降低（图3）。根据以上结果，我们将病毒感染量及细胞荧光素酶活性测定时间分别设定为病毒稀释比1∶5 和感染后 48 h。

为了评价该模型能否应用于高通量筛选，我们使用 Z′ 因子及 %CV 值评估该模型的质量。Z′ 因子能够同时反映信号的动态范围和数据变化程度，是评价高通量筛选方法稳定性的一个重要参数。Z′因子大于 0.5 且 %CV 值小于 20% 时，则认为该模型符合高通量筛选标准，适用于高通量药物筛选。表1 显示，这两种模型均符合高通量筛选的要求。

2.4阳性化合物对高通量筛选模型的检测

粉防己碱是钙离子通道阻断剂，具有抗炎、免疫及抗过敏等作用，同时被证明其能够抑制埃博拉病毒进入宿主细胞且在鼠体内的抗埃博拉研究中取得了很好疗效［8］。因此，我们以粉防己碱作为阳性化合物检测该高通量筛选模型的灵敏性。结果显示，不同浓度的粉防己碱与抗 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和 EBOV-GP-New/HIV-luc 假病毒活性呈现较明显的量效关系（图4），IC50值分别为 938.7 nmol/L 和 56.13 nmol/L。

图3　病毒稀释比与检测时间对荧光素酶活性的影响（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 3　Effects of viral dilution and detection time on luciferase activities （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/ HIV-luc）

表1　评价高通量筛选方法的统计学参数值Table 1　Summary of statistical parameters to assess its accuracy of the HTS assay

图4　粉防己碱的剂量效应关系（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 4　Dose-response relationship of tetrandrine （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/HIV-luc）

图5　样品初步筛选结果（A：格尔德霉素及其衍生物；B：大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物；C：天然产物单体化合物）Figure 5　Results of the preliminary screening （A： Geldanamycin and its derivatives；B： Macrolides fermentation broth and monomeric compounds； C： Monomeric compounds from natural products）

2.5样品的初步筛选

有研究表明格尔德霉素抑制埃博拉病毒的复制［9］，大环内酯类化合物具有广谱抗病毒作用［10］。因此，我们利用 EBOV-GP-Old/HIV-luc 筛选模型对相关样品进行了初步筛选，包括格尔德霉素及其衍生物 21 个、大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物45个和天然产物单体化合物 176 个（图5）。结果显示，格尔德霉素及其衍生物中有20 个样品对 EBOV 的抑制率高于 50%，阳性率达 95.23%。大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物和天然产物单体化合物的阳性率分别为48.89% 和 5.68%。

2.6活性样品的特异性分析

为了确认活性样品对 EBOV-GP 的作用特异性，在排除对细胞毒性因素后，还同时检测其对VSVG/HIV-luc 感染性的影响。VSVG/HIV-luc 与EBOV-GP/HIV-luc 有相同的 HIV 骨架，只是表面表达不同的病毒膜蛋白来介导病毒进入。若活性样品只对 EBOV-GP 介导的病毒进入有明显抑制作用，而对 VSV 病毒没有抑制或抑制率很低，则说明此样品对 EBOV 具有特异性。我们对初筛中获得的活性样品进行两种包膜病毒抑制率的比较，并设依法韦伦为对照组。结果显示，格尔德霉素及其衍生物、多数大环内酯类抗生素发酵液粗提品及单体化合物和天然产物同时对 VSVG/HIV-luc 与EBOV-GP/HIV-luc 发挥抑制作用。最终获得 4 种对 EBOV 具有特异性抑制作用的样品（图6）。

3　讨论

近年来，进入抑制剂已经成为一类新的抗病毒药物。EBOV-GP 蛋白介导 EBOV 与细胞表面受体的结合，通过病毒内吞作用和膜融合进入宿主细胞。阻断 EBOV-GP 介导的病毒进入将有效抑制病毒感染及由其引起的细胞毒性。因此，以 EBOV-GP为靶点进行抗埃博拉病毒药物的筛选不失为一种较为理想的策略。

为了实现在低生物安全环境下筛选靶向EBOV-GP 蛋白的抗埃博拉活性样品，本研究利用毒性最强的扎伊尔型 EBOV 的 GP 蛋白包裹 HIV核心制备复制缺陷型假病毒 EBOV-GP/HIV-luc，模仿 EBOV 的进入过程，并通过对病毒产量、感染比例及时间等因素进行优化，建立高通量筛选模型。同时利用 Z′ 值及阳性化合物的量效关系验证该模型的稳定性和灵敏性。

1：DMSO；2：EFV（5 nmol/L）；3：C51#（15 μmol/L）；4：C126# （2.5 μg/ml）；5：C173#（5 μg/ml）；6：B6#（2.5 μmol/L）图6　活性样品的特异性分析Figure 6　Analysis for the specificity of samples

通过该高通量筛选模型初步获得的活性样品至少会有 4 种类别：①EBOV-GP/HIV-luc 的进入抑制剂；②HIV 复制抑制剂；③荧光素酶活性抑制剂；④细胞毒性样品。因此，为了获得能够特异性抑制 EBOV 进入过程的活性样品，还需要利用表达不同包膜蛋白的 VSVG/HIV-luc 对初筛结果进行特异性分析。值得说明的是，在应用该模型对多组样品的初步筛选工作中，格尔德霉素及其衍生物具有较高阳性率且抑制率可达 90% 以上，但在与VSVG/HIV-luc 包膜病毒抑制率的比较后并未表现出对 EBOV 的特异性抑制作用。据研究报道，格尔德霉素以 Hsp90 为作用靶点发挥广谱的抗病毒作用，可能是通过降解病毒的 RNA 聚合酶或影响感染性 EBOV 的出芽释放过程［11］而对多种负链RNA 病毒发挥抗病毒作用的。本文的结果也表明格尔德霉素及其衍生物并不是通过阻断 EBOV 的进入过程来实现自身对 EBOV 的抑制的，但是，格尔德霉素对 EBOV 的高抑制率也从另一方面证明了该组样品做为抗 EBOV 药物的可能性。

综上所述，本文建立的抗 EBOV 进入药物筛选模型，靶点明确，步骤简单，稳定灵敏，可应用于高通量筛选影响 EBOV 进入过程的活性样品。抗 EBOV 进入药物筛选模型的建立有助于推动特异性药物机制研究，发现新的抗埃博拉病毒的有效药物。

参考文献

［1］ Hoenen T， Groseth A， Falzarano D， et al. Ebola virus： unravelling pathogenesis to combat a deadly disease. Trends Mol Med， 2006，12（5）：206-215.

［2］ Basu A， Li B， Mills DM， et al. Identification of a small-molecule entry inhibitor for filoviruses. J Virol， 2011， 85（7）：3106-3119.

［3］ Uebelhoer LS， Albaro CG， Mcmullan LK， et al. High-throughput，luciferase-based reverse genetics systems for identifying inhibitors of Marburg and Ebola viruses. Antiviral Res， 2014， 106：86-94.

［4］ Hoenen T， Groseth A， Callison J， et al. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res， 2013， 99：207-213.

［5］ Jasenosky LD， Neumann G， Kawaoka Y. Minigenome-based reporter system suitable for high-throughput screening of compounds able to inhibit Ebolavirus replication and/or transcription. Antimicrob Agents Chemother， 2010， 54（7）：3007-3010.

［6］ Gao Q， Wang Z， Liu Z， et al. A cell-based high-throughput approach to identify inhibitors of influenza A virus. Acta Pharm Sin B， 2014，4（4）：301-306.

［7］ Baize S， Pannetier D， Oestereich L， et al. Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea. N Engl J Med， 2014， 371（15）：1418-1425.

［8］ Sakurai Y， Kolokoltsov AA， Chen CC， et al. Two-pore channels control Ebola virus host cell entry and are drug targets for disease treatment. Science， 2015， 347（6225）：995-998.

［9］ Smith DR， Sarah MC， Andrew C， et al. Inhibition of heat-shock protein 90 reduces Ebola virus replication. Antiviral Res， 2010，87（2）：187-194.

［10］ Raveh A， Delekta PC， Dobry CJ， et al. Discovery of potent broad spectrum antivirals derived from marine actinobacteria. PLos One，2013， 8（12）：e82318.

［11］ Connor JH， McKenzie MO， Parks GD， et al. Antiviral activity and RNA polymerase degradation following Hsp90 inhibition in a range of negative strand viruses. Virology， 2007， 362（1）：109-119.

Author Affiliation: Department of Immunobiology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):193-199

Establishment and application of screening assay for EBOV entry inhibitor

WANG Jing， CHEN Shu-min， MA Ling， ZHANG Rui-xin， LI Zhuo-rong， YU Li-yan， CEN Shan

【Abstract】

ObjectiveTo establish a screening assay for EBOV entry inhibitors targeting EBOV glycoprotein and to screen samples with specific inhibition on the entry of EBOV by the models.

MethodsBy cell-based recombinant virus technology， the recombinant virus （EBOV-GP-Old/HIV-luc and EBOV-GP-New/ HIV-luc） were prepared by HIV core （pNL4-3.Luc） packed with two epidemic strains of EBOV glycoprotein， followed by further optimization of viral yield， infectivity， infection dose and determination time of luciferase activity. The stability and sensitivity of the assays were evaluated according to statistical parameters and positive compounds. 242 samples were screened and the vesicular stomatitis G packed pseudovirions （VSVG/HIV-luc） were used for analysis of sample specificity.

ResultsThe assay for EBOV entry inhibitors targeting GP protein was established. 4 samples were found to show the specific inhibition on the entry of EBOV using the HTS assay.

ConclusionThe assay is suitable for anti-EBOV drug screening and the obtained positive samples may lead toward the discovery of EBOV drugs.

【Key words】Ebolavirus；High-throughput screening assays；Entry inhibitor

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.001

基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301002-001-015）；国家自然科学基金青年基金（81501756）；国家微生物生物资源平台（NIMR-2015-3）

通信作者：岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

收稿日期：2015-12-16

Corresponding Author:CEN Shan， Email： shancen@imb.pumc.edu.cn