春季杨树叶片发育过程的研究*

宋玉光　马宗琪　董　蔚　杨发斌　杨晓刚　邱念伟

（曲阜师范大学生命科学学院野生动植物保护与利用重点学科实验室，山东　曲阜　273165）



春季杨树叶片发育过程的研究*

宋玉光马宗琪董蔚杨发斌杨晓刚邱念伟**

（曲阜师范大学生命科学学院野生动植物保护与利用重点学科实验室，山东曲阜273165）

摘要：杨树叶片发育从叶片大小（用叶面积表示）上看，其生长呈现出典型的“S”形曲线，在5月初叶面积达到最大；新生叶刚展开时叶绿素和类胡萝卜素就已开始合成，在5月底达到相对稳定的最大值；可溶性蛋白在叶片发育早期便达到成熟叶片水平。杨树叶片的PSII最大光化学效率、光能吸收和传递效率、质体醌库大小和反应中心数目等在4月底逐步趋于稳定，说明此时杨树叶片光系统已发育完善。荧光参数中性能指数PI在叶片成熟过程中变化最为灵敏，可以作为量化杨树叶片成熟度的指标。

关键词：杨树；叶片；发育；叶绿素荧光

*国家自然科学基金（31300220，31501328）；曲阜师范大学精品实验及实验室开放基金（SK201501，Jp2015018，sj201409）资助

杨树是我国最为著名的速生用材林和绿化树种，长期以来关于杨树的研究主要集中在速生品种选育、品质与抗性改良、基因资源挖掘等方面［3］，其叶片发育过程中的生理功能变化鲜有报道。

叶绿素荧光技术是检测叶片光合功能的快速、灵敏、无损伤的探针，可以灵敏检测激发能的传递、光系统Ⅱ（PhotosystemⅡ，PSⅡ）原初光化学反应、PSⅡ供体侧及受体侧的电子传递及光合效率等光合信息，为研究杨树叶片发育过程中光合功能的变化提供了新方法［1-2］。本文首次利用叶绿素荧光技术对杨树叶片发育过程进行了检测，并结合叶面积、蛋白质含量和光合色素含量等生理指标，系统揭示了杨树叶片的生长发育规律。

1材料与方法

1.1试验材料

植物材料为曲阜师范大学校园内（35°36′N，116°58′E，海拔60.5m）生长健壮、树龄在10年左右的毛白杨（Populus tomentosa）朝阳部分。从4月2日幼叶刚展开时开始收集样本进行测定，每隔5天取样1次，截止到5月2日（叶绿素和类胡萝卜素的测定取样延长至5月31日，从5月2日以后每10天取样次）。每早晨8点摘取1年生枝条上的最大叶片，用湿纱布包裹，迅速带回实验室测定其叶面积、叶绿素含量、类胡萝卜素含量和蛋白质含量，晚上8点充分暗适应后，活体测定叶绿素荧光参数。叶片采自同一颗杨树的下部枝条。

1.2叶面积的测定

杨树叶片的叶面积用Li-3000A型叶面积仪（美国LI-COR）测定，每次采样测定5个重复。

1.3叶绿素、类胡萝卜素含量测定

取样后，用打孔器打取3个叶圆片，切成0.1mm宽的细丝，用80％丙酮浸泡提取叶绿素和类胡萝卜素，具体测定步骤参照张秀君等2011年的方法［3］。

1.4叶绿素快相荧光动力学参数的测定与解析

晚上杨树叶片充分暗适应后，用植物效率分析仪（Handy PEA；Hansatech Instrument Ltd.，UK）活体测定不同时期叶片的叶绿素荧光动力学参数。测定光源的波长为650nm，光照强度为3000μmol·m-2·s-1，光束聚集在直径为4mm2的叶片夹测试孔上，荧光信号的记录时程为1s，每个时期的叶片测定10个重复。利用专业软件可解析出以下荧光参数：标准化面积（Sm=Area/Fv），该参数与质体醌库的大小成正比；PSII最大光化学效率（Fv/Fm）；单位激发态面积被反应中心捕获的能量（TRo/CSo）；单位激发态面积吸收的能量（ABS/CSo）；单位激发态面积的反应中心密度（RC/CSo）；单位激发态面积用于电子传递的能量比例（ETo/CSo）；单位激发态面积以热能形式耗散的能量比例（DIo/CSo）；叶片的综合性能指数（PI）。

1.5可溶性蛋白含量测定

叶片可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G250染色法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，每个时期的样品做5个重复，具体步骤参照邱念伟等2013年的方法［4］。

2结果与分析

2.1杨树叶片发育过程中叶面积的变化

4月份杨树叶片生长较快，叶面积的变化规律呈典型的“S”型，即早期（4月2日前后）生长较慢；随后进入对数生长期（4月7日～4月22日），叶面积成倍增大；最后阶段（4月27日～5月2日）叶面积达到最大值并趋于稳定（图1）。从每5天叶面积增大倍数上看，4月2日～12日的增大倍数最大，分别增大了2.53倍和2.41倍，之后依次为1.86、1.57、1.06和1.01倍，4月22日后叶面积趋于稳定，杨树叶片叶面积的增大大约只需要3周（4月2日至4月22日）。

图1　杨树叶片发育过程中叶面积的变化规律

2.2杨树叶片发育过程中光合色素含量的变化

植物的光合色素主要有叶绿素和类胡萝卜素两类，通过测定整个叶片发育过程中两种色素的含量发现，杨树叶片在4月2日刚展开时已合成了少量叶绿素和类胡萝卜素，随后两者的含量均逐渐增高，到5月底时均达到最高值，并仍有微弱的增大趋势（图2）。从两者的整体增长速率来看，叶绿素的增长速率远远高于类胡萝卜素，在叶片发育早期（4月2日至4月17日），叶绿素和类胡萝卜素的增长速率相似，但从4月17日开始，叶绿素的增长速率则明显快于类胡萝卜素，5月22日以后两者的增长速率明显变缓（图2）。从叶绿素和类胡萝卜素的含量上分析，无论初始含量还是最终含量，叶绿素均明显高于类胡萝卜素，为类胡萝卜素的1.5～3.8倍；随着叶片成熟，二者的比例逐渐增大，如叶片刚展开时叶绿素含量约为1.31mg/dm2，而类胡萝卜素含量约为0.82mg/dm2；叶片发育成熟以后叶绿素含量达到8.34mg/dm2，而类胡萝卜素含量仅为2.25mg/dm2。

图2　春季杨树叶片光合色素含量的变化规律

2.3杨树叶片发育过程中可溶性蛋白的变化

可溶性蛋白质含量是反映叶片活力的常用生化参数。通过测定杨树叶片中可溶性蛋白含量发现，在杨树叶片发育过程的前期阶段（4月2日～12日），其可溶性蛋白含量快速增多，从最初的2.96mg/gFW增加到4.14mg/gFW。随后其含量缓慢增大，并很快趋于稳定，最终增大至约4.3mg/gFW（图3）。表明在叶片发育过程中需要大量蛋白质的参与，在叶片发育早期就需要大量合成蛋白质。

图3　春季杨树叶片可溶性蛋白含量的变化规律

2.4杨树叶片发育过程中光合功能的变化

叶绿素荧光技术不仅能够测定叶片的光合活力，也能探测叶片光合结构和光合效率的变化，是研究叶片功能的高新技术。由表1可知，杨树叶片的最大光化学效率（Fv/Fm）在叶片展开后便快速增大，在4月17日时已经接近成熟叶片（所有高等植物的成熟健康叶片的Fv/Fm值均在0.830左右），说明此时PSII的结构已经比较完善，叶片质体醌库的大小（Sm）随着叶片的发育也呈逐渐增大趋势，说明杨树叶片的电子传递能力在逐渐增强；单位激发态面积的光能吸收和利用效率参数（ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo）结果显示，从4月12日开始杨树叶片的光合效率逐渐趋于稳定；单位激发态横切面的热能耗散比例（DIo/CSo）随叶片的成熟稍有波动，但从4月7日开始便趋于相对稳定；叶片的综合性能指数（PI）是杨树叶片发育过程中变化最为敏感的，随着叶片的发育成熟呈逐渐增大趋势，在5月2日时达到最大值，说明此时杨树叶片的光合系统已基本完善。

表1　春季杨树叶片光合功能变化规律

3讨论

3.1杨树春季叶片的发育是其后续一切发育的基础，从其叶面积的测量数据来看，杨树萌发的幼叶发育为成熟叶片仅需3周的时间，发育过程中叶面积的变化呈现出典型的“S”形曲线，这与我们前期测量的杨树叶片发育模式一致［10］。杨树叶片刚刚从叶芽萌发时（4月2日的叶片），其叶面积仅为成熟叶片的4.8％，但其叶绿素、类胡萝卜素以及质体醌库大小已经分别达到成熟叶片的15.6％、36.4％和43.0％，说明此时已经具备了一定的光合能力，另外在叶片发育最初的5天内（4月2日～7日），其光能吸收和利用效率的相关参数（ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo）均快速增长并达到接近成熟叶片的水平，表明在叶片发育初期，其主要任务是尽快的建立成熟的光合系统，进行光合作用，为叶片后续的发育提供物质和能量，这与其他物种叶片的发育模式是一致的［5］。在各个叶绿素荧光参数中，单位激发态面积以热能形式耗散的能量比例（DIo/CSo）的变化比较特殊，在叶片发育前期其数值相对较低，而发育后期则逐渐升高，而后又稍有下降。推测这是由于叶片发育早期其吸收的光能较少，因此热耗散较少；而前半期光合系统还未完全成熟，吸收光能中用于光合作用的比例较低，以热能形式耗散的比例较大［6］；后期叶片光合功能完善，光合效率升高，热耗散反而又有所下降。4月22日时，杨树叶片的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）已接近成熟叶片的正常值，此时PSII的结构已完整构建，且PSII反应中心的数量已经达到成熟叶片的95.7％，此时光合效率显著提高，DIo/CSo迅速下降。荧光参数中叶片综合性能指数（PI）变化最为灵敏，4月7日至5月2日的PI值分别为4月2日的1.32、1.56、1.88、1.96、2.00、2.10倍，已有文献证明PI与植物的光合速率呈正比［7］，因此可用PI来量化杨树叶片的发育成熟程度。

3.2在4月22日时，杨树的叶面积便接近成熟叶片，但其叶绿素含量仅为成熟叶片的50％，其叶片扩展速度远快于叶绿素、类胡萝卜素的增长速度。由于植物体内叶绿素、类胡萝卜素的合成受到了温度和光照强度的严格调控，且两种色素的合成非常复杂，整个生物合成过程需要十几步反应以及几十种酶的参与才能完成［8］，所以随着光照强度和温度的升高，叶片内的叶绿素和类胡萝卜素的合成才逐渐达到最高水平。

3.3叶片可溶性蛋白含量测定结果显示，在杨树叶片刚刚露出叶芽时其内部的可溶性蛋白含量就比较高，说明杨树嫩叶代谢比较旺盛。随着叶片的继续发育，在15天后便接近成熟叶片的含量。由于可溶性蛋白还是植物重要的渗透调节物质和抗逆保护物质，其含量的快速增大和积累能提高细胞的保水能力和抗冷能力，是植物抗寒性的重要指标之一［9-10］。因此推测在叶片发育早期，由于气温还普遍偏低，杨树叶片中可溶性蛋白的快速积累除了为促进幼叶的代谢活动外，还具有保护叶片不会受到冷冻伤害的功能。

参考文献

［1］陈莲花，刘雷.叶绿素荧光技术在藻类光合作用中的应用［J］.江西科学，2007，25（6）：788-790.

［2］李鹏民，高辉远，Strasse RJ.快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用［J］.植物生理学与分子生物学学报，2005，31（6）：559-566.

［3］张秀君，孙钱钱，乔双，等.菠菜叶绿素提取方法的比较研究［J］.作物杂志，2011（3）：57-60.

［4］邱念伟，周峰，王颖，等.松树与杨树叶片叶绿素快相荧光动力学特征比较［J］.林业科学，2013，49（3）：136-143.

［5］Koehn AC，Roberds JH，Doudrick RL.Variation among slash pine families in chlorophyll fluorescence traits［J］.Canadian Journal of Forest Research，2003，33（6）：1102-1109.

［6］杨翠翠，彭帅，李爽，等.银杏叶片发育过程中叶绿素快相荧光动力学的特征研究［J］.林业科技，2013，38（3）：9-11.

［7］邱念伟，周峰，顾祝军，等.5种松属树种光合功能及叶绿素快相荧光动力学特征比较［J］.应用生态学报，2012，23（5）：1181-1187.

［8］王平荣，张帆涛，高家旭，等.高等植物叶绿素生物合成的研究进展［J］.西北植物学报，2009（29）：629-636.

［9］何云，李贤伟，李西，等.2种野生岩生植物叶片可溶性蛋白含量对低温胁迫的响应［J］.安徽农业科学，2008，36（18）：7552-7553.

［10］王学顺，孙一丹，黄安民.木材红外光谱的树种识别研究［J］.2015，31（6）：65-70.

（责任编辑：张亚楠）

Study on the Development Process of Populus tomentosa Leaf in Spring

SONGYuguang
（College of Life Science，Qufu Normal University，Shandong Qufu 115200）

AbstractPopulus tomentosa is the species which are widely distribute d，adaptable and often used as fast growing timber and urban afforestation.To acquire more information about Populus tomentosa's growth rule，the development process of its leaves were observed systematically.Looking from the size of leaf（expressed in leaf area），the growth curve of Populus tomentosa leaf clearly show a“S”shape，and leaf area reached a maximum size in early May.At last reached the relatively stable maximum content at the end of May.The accumulation of soluble protein in young leaves was very fast，then quickly reached the content of mature leaves.Performance index of plants（PI）is the most sensitive parameter among all the fluorescence parameters，which can be used to quantize photosynthetic function of Populus tomentosa leaf during the development process.

Key wordsPopulus tomentosa；Leaf；Development；Photosynthesis

中图分类号：S792.11，S718.3

文献标识码：A

文章编号：1001-9499（2016）03-0020-04

作者简介：第1宋玉光（1983-），男，讲师，研究方向：表观遗传与植物的逆境胁迫响应。

收稿日期：2016-02-11