RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用

张国禄，程世翔，徐忠伟，衣泰龙，涂 悦*，张 赛

(1.武警后勤学院附属医院脑科医院，天津市神经创伤修复重点实验室，武警部队脑创伤与神经疾病研究所，天津 300162；2.武警后勤学院中心实验室 天津 300309)



·论 著·

RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用

张国禄1，程世翔1，徐忠伟2，衣泰龙1，涂 悦1*，张 赛1

(1.武警后勤学院附属医院脑科医院，天津市神经创伤修复重点实验室，武警部队脑创伤与神经疾病研究所，天津 300162；2.武警后勤学院中心实验室 天津 300309)

目的探索受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)的下游信号通路。方法向实验组SH-SY5Y细胞内转染pCMV6-RIPK3 质粒上调细胞内RIPK3的表达水平，对照组细胞转染相应的空载质粒。通过Western blot检测细胞内RIPK3的表达水平。3-(4，5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)，MTT]实验获得2组细胞增殖曲线确定外源性RIPK3在细胞内具有的生物学活性。通过RNAseq检测2组细胞基因转录差异，并在生物通路分析(ingenuity pathway analysis，IPA)数据库中进行数据分析，获得RIPK3的下游信号通路及其中的关键分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)。采用微滴式数字化PCR(droplet digital PCR，ddPCR)对mTOR转录水平的差异进行验证。结果质粒DNA整合到细胞基因组内，Western blot 提示外源性RIPK3在实验组细胞内稳定表达，MTT结果证明其在细胞内能够抑制细胞增殖。RNAseq及IPA分析结果提示过表达RIPK3能够导致mTOR转录水平发生上调，并对其下游的基因，包括固醇反应结合蛋白(sterol-response binding proteins，SREBPs)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70 ribosomal S6 protein kinases，S6K)、真核生物起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins，4E-BPs)和ULK(unc-51-like kinase)激酶复合体的转录具有明显的调节作用。ddPCR实验结果中mTOR表达改变趋势与RNAseq基本一致。结论 RIPK3能够调控mTOR及其下游信号通路中SREBPs、S6K、4E-BPs和ULK基因转录水平，进而在神经系统生长发育和疾病进展中发挥重要作用。

神经母细胞瘤；受体相互作用蛋白激酶-3；基因表达调控

受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介导程序性坏死(necroptosis)信号通路中的关键分子，在TNF-α的作用下能够被受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)激活，进而发挥出典型的丝/苏氨酸蛋白激酶活性。近期的研究提示：RIPK3在凋亡、程序性坏死等细胞可控性细胞死亡过程中发挥着重要的作用[1]，是潜在的调节甚至逆转细胞死亡进程的靶点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够调节细胞新陈代谢并改善细胞在不同环境下的生长状态。mTOR信号通路的下调出现在多种疾病中[2]，包括神经元轴突修复、神经退行性疾病和癌症。本研究将RIPK3与mTOR信号通路联系起来，扩展了RIPK3在神经系统中发挥生物活性的新途径，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(ATCC公司)。

1.1.2 试剂 DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司)，pCMV6-AC-GFP质粒(OriGene公司)，质粒小提中量试剂盒(TIANGEN公司)，Lipofectamine 3000(Life公司)，兔抗GAPDH抗体、小鼠抗RIPK3抗体(Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗(KPL公司)，G418、TRIzol试剂(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(CWBIO公司)，EvaGreen Supermix(Bio-Rad公司)。

1.1.3 仪器设备 Thermo Scientific CO2培养箱(Thermo公司)，倒置显微镜及激光共聚焦显微镜(Leica公司)，Multiskan FC酶标仪(Thermo公司)，基础型电泳电源，小型垂直电泳系统，半干转印系统，QX200微滴式数字PCR系统(Bio-Rad公司)，AI600凝胶成像系统(GE公司)。

1.2 方法步骤

1.2.1 细胞培养 DMEN/F12培养基中加入10% FBS构成完全培养基用于常规培养，0.25%胰酶、0.53 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液消化为单细胞悬液进行传代，于细胞培养箱中培养，培养条件为95%空气与5%CO2混合气体，温度设定为37 ℃,冻存液为含5%二甲基亚砜的完全培养基，冻存细胞保存于液氮。

1.2.2 细胞转染 合成空载及携带有RIPK3-GFP基因系列的pCMV6质粒，转化DH5-α感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的LB平板培养基和液体培养基中分别进行筛选和扩增，按照试剂盒所附说明书提取质粒DNA，定量后保存于-80 ℃。按照标准步骤采用Lipofectamine 3000试剂转染，SH-SY5Y细胞接触密度约为50%并常规培养48 h，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluore scent protein,GFP)表达情况，GFP阳性细胞以G418浓度为1 000 mg/L的完全培养基进行筛选以获取稳定转染的SH-SY5Y细胞，传代2次后G418浓度减为800 mg/L维持培养，并冻存细胞备用。

1.2.3 Western blot 取对数生长期的细胞，蛋白裂解液(radio immunopreciptation assay,RIPA)裂解细胞并进行超声裂解，12 000 g×10 min离心后取上清，BCA试剂盒定量后按比例加入loading buffer 100 ℃×10 min变性。垂直凝胶电泳每泳道上样量为25 μg，80 V恒压电泳，将分离后的蛋白半干转膜法转移到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，一抗孵育过夜，次日洗膜并加二抗，于室温孵育2 h。洗膜后滴加ECL化学发光剂，在AI600凝胶成像系统中成像。

1.2.4 3-(4，5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)，MTT]实验 将细胞消化成单细胞悬液稀释至5×104/mL，在预定时间点接种至96孔板，设3组重复。常规培养，按实验要求培养至相应时间点，向培养孔中加入MTT并孵育4 h，去上清酶标仪检测获得490 nm波长处光吸收值。实验重复3次。对数据进行统计学分析。

1.2.5 基因转录水平差异检测及数据分析 TRIzol法提取细胞总RNA，利用携带polyT黏性末端的磁珠富集mRNA并进行质控检测。将富集获得的mRNA打断为短片段，并逆转录为互补DNA(complementary DNA，cDNA)，对其进行修复及适当修饰并进行筛选，筛选后通过PCR建立cDNA文库。对cDNA文库进行检测确认其符合后续实验要求，上机测序。实验结果在生物通路分析(ingenuity pathusay analysis,IPA)数据库中进行数据分析，以GAPDH为内参计算基因相对转录水平=(目的基因RPKM/GAPDH基因RPKM)×100%。

1.2.6 微滴式数字化PCR(ddPCR) 细胞总RNA逆转录为cDNA，将MILIQ 水、cDNA、引物及ddPCR EvaGreen Supermix按要求配比，构成的20 μL反应体系并微滴化。按照95 ℃×10 min，循环条件为95 ℃×30 s，60 ℃×1 min，72 ℃×1.5 min，循环次数为40次进行扩增。在完成反应后90 ℃维持5 min以稳定微滴。以QX200微滴读取仪进行信号采集，并对实验数据进行分析[QuantaSoft(1.3.2.0)软件]获得基因拷贝数，以GAPDH为内参进行校正后计算基因相对转录水平=(实验组转录水平/对照组转录水平)×100%。引物序列见表1。

表1 ddPCR 引物序列

2 结果

2.1 外源性RIPK3表达 转染后的2组细胞均表达GFP，在激光共聚焦显微镜下可见绿色荧光(图1)，质粒DNA整合到细胞基因组内。对2组细胞蛋白进行Western blot检测，对照组仅表达相对分子质量为56 000的内源性RIPK3，实验组在表达内源性RIPK3的同时，表达相对分子质量为85 000的外源性RIPK3(外源性RIPK3与GFP形成融合蛋白)(图2)。

图1 2组细胞转染的携带有RIPK3、空载质粒中均携带有GFP标签，转染后在激光共聚焦显微镜下可观察到绿色荧光

A.对照组;B.实验组

Figure 1 SH-SY5Y in both groups expressed GFP after transfection

图2 外源性RIPK3-GFP在实验组细胞内表达(内源性RIPK3相对分子质量为 56 000，外源性RIPK3相对分子质量为85 000)

Figure 2 Exogenous RIPK3 was expressed in test group(endogenously expressed RIPK3 has a molecular weight of 56 000,endogenously expressed RIPK3 has a molecular weight of 85 000)

2.2 MTT法检测2组细胞不同时间点的增殖活性 2组的细胞增殖活性随着时间的延长逐渐增高，实验组的16、24、32、40 h增殖活性均较对照组明显降低(P<0.05),见表2。

表2 2组MTT实验数据比较

2.3 转录组检测及分析 在IPA数据库中对RNAseq结果进行数据分析,结果显示RIPK3下游存在以mTOR为核心的下游信号通路，信号通路中的各基因及作为信号节点的mTOR转录受到明显的调控， SREBPs、S6K、eIF4B、eEF2K及ULK的表达水平发生了相应的改变(图3)。ddPCR结果表明实验组与对照组细胞mTOR转录水平比值为0.028±0.005vs0.055±0.014 ，其转录水平差异有统计学意义(t=3.011,P<0.05)(图4)。

图3 mTOR及其下游信号分子转录水平改变情况

Figure 3 Transcription level changes of MTOR and its downstream signaling molecules

图4 ddPCR检测提示mTOR转录水平变化与RNAseq一致

横坐标为微滴计数，纵坐标为微滴荧光强度，通过检测PCR管内阳性荧光微滴数目及所占比值，计算得出样本中的目的基因片段绝对浓度(copies/μL)

Figure 4 ddPCR detection suggested that the change of transcription level of mTOR was consistent with RNAseq

3 讨 论

RIPK3是一种典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在RIPK1的作用下被激活，进而发挥广泛的下游效应。本研究以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为神经元细胞模型[3]，在细胞内上调RIPK3表达水平。通过RNAseq技术对转录组mRNA进行测序，对细胞内由RIPK3上调所引起基因转录变化情况进行全面的了解，在IPA数据库中对测序结果进行分析，获得受到RIPK3调控的信号通路。对处于核心位置的基因，采用ddPCR对RNAseq结果进行验证，保证实验结果的可靠性。RNAseq结果提示，在RIPK3表达水平发生上调的情况下，mTOR及其所在的信号通路中的信号分子SREBPs、S6K、eIF4B、eEF2K及ULK表达发生了不同情况的改变。

mTOR是一种相对分子质量为289 000的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，在细胞内以mTORC1和mTORC2两种分子复合体的形式发挥生物学活性[4]。mTORC1在促进髓鞘形成和脊髓髓磷脂厚度的作用强于mTORC2，在调控脂肪合成和髓鞘蛋白翻译等过程中起到了重要的作用[5]。mTOR介导的细胞内信号通路被认为是调节干细胞功能的关键性调控因子[6]，胚胎干细胞中mTOR活性被控制在较低水平，抑制中枢神经系统中mTOR活性能够通过降低大脑中干细胞的功能而导致严重的后果[7]。对早期胚胎的研究发现，mTOR的活化能够导致皮层结构异常发育、神经退行性变甚至早期死亡[8]。这预示着mTOR在脑早期发育的过程起到关键性作用。也有证据表明，mTOR信号通路参与到阿尔兹海默症的发生和发展过程中[9]，并与无功能性垂体腺瘤的发病具有一定的联系[10]

本研究结果表明，mTOR及下游效应分子表达的改变受到RIPK3系统化的严格调控。其作用机制涉及转录、翻译以及自噬。SREBPs是mTORC1下游最重要的转录因子，其活性受到SREBPs在神经系统中的作用尚未完全明确。但有研究表明其在营养监测、兴奋性中毒、髓鞘化和神经退行性疾病中发挥重要作用[11]。mTOR对翻译过程的调控主要通过S6K和4E-BPs。S6K由能够磷酸化核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6，S6)、真核生物起始因子4B(eukaryotic initiation factor 4B，eIF4B)以及真核生物延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K)，从而促进新生肽链合成起始和延长[12]。真核生物起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E ，eIF4E)通过与mRNA5′端帽结构相结合发挥负调节的作用，与4E-BPs结合状态下的eIF4E为失活状态， 4E-BPs被mTOR磷酸化释放出的游离状态的eIF4E才能够与mRNA的帽状结构结合[13]。自噬是指细胞对氨基酸、大分子和受损细胞器进行回收的过程，自噬现象在神经元细胞中较非神经元细胞更为明显，如Tsc2缺陷型神经细胞在mTORC1活化的情况先能够表现出溶酶体积累增加，并保持自噬能力[14]，mTOR信号通路在脊髓的形成过程中发挥了重要的作用[15]。mTORC1通过与ULK的相互作用对这一过程进行调节，以雷帕霉素抑制mTORC1能够引起自噬的发生[16]。

研究人员在很多临床疾病中发现mTOR信号通路的异常情况，这些疾病包括由mTOR信号通路异常引起的单基因遗传疾病，如结节性硬化、抑癌基因PTEN错构瘤肿瘤综合征、多发性神经纤维瘤病；神经发育障碍，如脆性X综合征、自闭症、癫痫病；神经退行性疾病，如衰老、阿尔兹海默综合征、帕金森综合征、亨廷顿病、精神病等[17]。

综上所述，RIPK3可以通过对mTOR信号通路的调节而对神经系统的发育及疾病病理产生重要的影响。由于受到诸多条件的限制，本研究并没有对RIPK3与mTOR信号通路之间的关系进行更加深入的探讨，但是仍然支持了RIPK3在神经系统中发挥重要作用的观点，并为进一步的研究指明了方向。

[1] Vanden Berghe T,Linkermann A,Jouan-Lanhouet S,et al. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(2):135-147.

[2] Laplante M,Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease[J]. Cell,2012,149(2):274-293.

[3] Chen T,Ma Z,Zhu L,et al. Suppressing receptor-interacting protein 140:a new sight for salidroside to treat cerebral ischemia[J]. Mol Neurobiol,2015[Epub ahead of print].

[4] Walker NM,Belloli EA,Stuckey L,et al. Mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) and mTORC 2 as key signaling intermediates in mesenchymal cell activation[J]. J Biol Chem,2016[Epub ahead of print].

[5] Lebrun-Julien F,Bachmann L,Norrmén C,et al. Balanced mTORC1 activity in oligodendrocytes is required for accurate CNS myelination[J]. J Neurosci,2014,34(25):8432-8448.

[6] Wang S,Xia P,Ye B,et al. Transient activation of autophagy via Sox2-mediated suppression of mTOR is an important early step in reprogramming to pluripotency[J]. Cell Stem Cell,2013,13(5):617-625.

[7] Lee da Y. Roles of mTOR signaling in brain development[J]. Exp Neurobiol,2015,24(3):177-185.

[8] Kassai H,Sugaya Y,Noda S,et al. Selective activation of mTORC1 signaling recapitulates microcephaly,tuberous sclerosis,and neurodegenerative diseases[J]. Cell Rep,2014,7(5):1626-1639.

[9] Siman R,Cocca R,Dong Y. The mTOR inhibitor rapamycin mitigates perforant pathway neurodegeneration and synapse loss in a mouse model of early-stage alzheimer-type tauopathy[J]. PLoS One,2015,10(11):e0142340.

[10] 李鹏，张庆九，马法,等.PI3K、Akt和mTOR在无功能性垂体腺瘤中的表达[J].河北医科大学学报，2015，36(9):1064-1068.

[11] Bar-Peled L,Chantranupong L,Cherniack AD,et al. A Tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1[J]. Science,2013,340(6136):1100-1106.

[12] Ma XM,Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(5):307-318.

[13] Richter JD,Sonenberg N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins[J]. Nature,2005,433(7025):477-480.

[14] Di Nardo A,Wertz MH,Kwiatkowski E,et al. Neuronal Tsc1/2 complex controls autophagy through AMPK-dependent regulation of ULK1[J]. Hum Mol Genet,2014,23(14):3865-3874.

[15] Tang G,Gudsnuk K,Kuo SH,et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits[J]. Neuron,2014,83(5):1131-1143.

[16] Nixon RA. The role of autophagy in neurodegenerative disease[J]. Nat Med,2013,19(8):983-997.

[17] Lipton JO,Sahin M. The neurology of mTOR[J]. Neuron,2014,84(2):275-291.

The role of RIPK3 overexpression in regulation of the transcription of mTOR and downstream genes

ZHANG Guo-lu1, CHENG Shi-xiang1, XU Zhong-wei2,YI Tai-long1，TU Yue1*, ZHANG Sai1

(1.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Institute of Traumatic Brain Injuryand Neuroscience of Chinese Armed Police Forces (CAPF), Neurology & Neurosurgery Hospital of CAFP, Tianjin 300162, China; 2. Center Laboratory of Logistics University of CAPF, Tianjin 300309, China)

Objective The aim of this study is to investigate the downstream pathway of receptor-interacting protein kinase 3(RIPK3). Methods SH-SY5Y was stably transfected with pCMV6-RIPK3 recombinant plasmid to up-regulate expression of RIPK3, while control group was transfected with empty vector. RIPK3 level in transfected SH-SY5Y cells were determined using western blot. Cell proliferation activity was measured by MTT to detect the activity of exogenous RIPK3. The differentially transcripted genes between two groups were identified by RNAseq. Ingenuity pathway analysis(IPA) revealed a great role of RIPK3 and its downstream signal pathways and the key molecule mammalian target of rapamycin (mTOR). Droplet digital PCR(ddPCR) analysis was used to further confirm expression of mTOR. Results Plasmid DNA was integrated into the cell genome. Western blotting results suggested that exogenous RIPK3 was expressed in experimental group. MTT results showed that exogenous RIPK3 could inhibit cell viability. RNAseq and IPA shown that overexpression of RIPK3 upregulated the transcription levels of mTOR, and affected downstream genes such as sterol-response binding proteins(SREBPs), p70 ribosomal S6 protein kinases(S6K), eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins(4E-BPs) and unc-51-like kinase (ULK). ddPCR analysis show that the change of the expression level of mTOR was the same as that of RNAseq. Conclusion RIPK3 could regulate transcription of mTOR signal cascade and play an important role in development, inflammation and tumorigenesis of the nervous system.

neuroblastoma; receptor-interacting protein kinase 3; gene expression regulation

2015-11-23；

2016-03-02

国家自然科学基金青年科学基金项目(31200809)；武警部队后勤科研项目(WJHQ2012-20)；武警后勤学院科研创新团队(WHTD201306)

张国禄(1990-)，男，辽宁朝阳人，武警后勤学院附属医院医学硕士研究生，从事神经外科学疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:ytumail@vip.126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.002

R730.264

A

1007-3205(2016)04-0377-05

许卓文)