不同前列腺癌细胞株Talin-1表达情况和侵袭能力关系研究*

陈慧军许 宁陈少豪 陈锦添 李晓东 蔡 海 薛学义 魏 勇郑清水福建医科大学附属第一医院泌尿外科 （福州　350005）



不同前列腺癌细胞株Talin-1表达情况和侵袭能力关系研究*

陈慧军△许 宁△陈少豪 陈锦添 李晓东 蔡 海 薛学义 魏 勇**郑清水
福建医科大学附属第一医院泌尿外科 （福州350005）

摘要目的 探讨踝蛋白1（Talin-1）在不同前列腺癌细胞株中的表达情况和侵袭能力的关系。方法体外培养不同人前列腺癌细胞株（DU-145、PC-3、LNCaP）及人正常前列腺上皮细胞株（RWPE-1）。传代培养后利用MTT法检测各细胞株增殖能力。细胞划痕实验，Transwell小室侵袭和迁移实验检测各细胞株侵袭及迁移能力。RT-PCR技术检测各细胞株中Talin-1的mRNA表达水平。Western-blot技术检测各细胞株中Talin-1的蛋白表达水平。结果 与RWPE-1细胞株相比，LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株的增殖、侵袭和迁移能力明显增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株的增殖、迁移以及侵袭能力依次递增（P＜0.05）。前列腺癌LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株中的Talin-1 mRNA及蛋白表达水平显著高于RWPE-1细胞株（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的Talin-1 mRNA以及蛋白表达水平依次递增（P＜0.05）。结论Talin-1与前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力相关；低表达Talin-1的前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力低，恶性度低；高表达Talin-1的前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力强，恶性度高。Talin-1可作为前列腺癌恶性度的预测指标之一。

关键词前列腺肿瘤； 细胞支架蛋白质类；肿瘤侵润

△共同第一作者

前列腺癌（Prostate cancer， PCa）是西方国家男性最常见的恶性肿瘤之一，近年我国特别是沿海地区前列腺癌的发病率也逐年上升［1， 2］。前列腺癌如果发生远处转移，5年生存率将降到28%左右［3］。目前认为肿瘤转移同肿瘤细胞自身基因表达的改变以及肿瘤周围微环境的变化有关［4］。前列腺癌转移是一个复杂多步骤的过程，主要包括肿瘤细胞脱离，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）退化、细胞迁移、独立锚增长、细胞凋亡、新血管形成、侵入周围组织，细胞黏附、移动并嫁接到身体远处部位等［5］。

踝蛋白1（Talin-1）是一种高分子量的细胞骨架蛋白，主要位于细胞和细胞外基质间的黏性复合物上，起到调节整合素（integrin）和黏着斑信号（focal adhesion signaling）的作用［6］，并与黏附激酶（Focal Adhesion Kinase，FAK）和肌动蛋白相结合，诱发细胞骨架重构，导致细胞黏附和迁移［7］。研究发现Talin-1的表达促进肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭以及抗凋亡。Jin等［8］发现Talin-1磷酸化通过激活β1-整合素蛋白促进前列腺癌骨转移。

本研究探讨Talin-1在不同前列腺癌细胞株中的表达差异及与前列腺癌细胞生物学特性关系。

材料和方法

一、材料

人前列腺癌细胞株（D U - 1 4 5、P C - 3、LNCaP）、人正常前列腺上皮细胞株（RWPE-1）和羊抗小鼠IGG-HRP均购自福州鼎国生物科技有限公司。DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶和DMSO均购自美国GIBCO公司；DAPT购自美国Sigma公司；Talin-1抗体购自abcom公司；RNA 提取试剂盒Trizol Reagent购自Invitrogen公司。其余有关分子生物学试剂均由福建医科大学附属第一医院中心实验室提供。

二、方法

（一）MTT增殖实验

根据混入油品在气测上的响应特征，可进一步区分真假油气显示。现以国内某油田一水平井为例，分析如何识别混油情况下的油气层特征。

取对数期细胞，调整细胞悬液浓度，孵育至细胞单层铺满孔底（5%CO2，37℃），加入对应浓度药物。孵育16～48h，倒置显微镜观察。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT培养液。终止培养吸去孔内液。每孔加入二甲基亚砜150μL，摇床低速振荡10min，溶解结晶物。酶联免疫监测仪上490nm波长测定各孔光密度值（OD）并记录结果。

（二）细胞划痕实验

取对数期细胞，稀释调整细胞密度，制备单层细胞。用移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，孵育24h。吸去培养液，用PBS清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

（三）Transwell小室

取对数期细胞，细胞饥饿1 2 h，接种于Transwell小室，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。24h后取出Transwell小室，PBS冲洗2次后倒置小室，自然风干。甲醛固定，结晶紫染色，高倍镜下分别选择上下左右及中间5个视野，统计视野中细胞数，以穿膜细胞数表示各组细胞的侵袭和迁移能力。

（四）RT-PCR检测前列腺细胞中mRNA的表达

T a l i n - 1 m R N A引物：上游引物5’-TCGTCCCAAAATGCCAAGAAC-3’，下游引物5’-TGGCTATTGGGGTCAGAGAC-3’，扩增片断长度为276bp。内对照β-actin引物：上游引物5‘-AGCGAGCATCCCCCAAAGTF-3’，下游引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，扩增片断长度为285bp。取对数期细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，每份细胞总RNA经逆转录成cDNA模板链后，取2μL cDNA模板配置25μL PCR反应体系，震荡混匀后短暂离心，置于PCR扩增仪中扩增。用微量移液器将sybr green荧光染料1μL、扩增后DNA样品5μL和DNAMaker 5μL混匀后再缓慢加到电泳槽内，接通电源，当样品各条带已跑到预期位置，切断电源。紫外照相并进行分析扫描。mRNA表达相对值=目的片段光密度值/β-actin光密度值。

（五）蛋白印迹（Western blot）分析蛋白的表达

取对数期细胞，裂解离心得到总蛋白，采用bradford比色法测定蛋白含量。SDS PAGE电泳分离40μL样本，利用电转印法使蛋白转移至PVDF膜上，4℃封闭过夜后加入一抗孵育2h，TBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育（37℃，1h），孵育结束后TBST再次洗涤3次，最后曝光显影。

三、统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，实验数据以（x±s）的形式表示，单因素方差分析（One-way ANOVA）对不同组间数据差异进行比较，SNK法（Student-Newman-Keuls）数据之间差异进行两两比较。检验水准 α=0.05，以P＜0.05 为有统计学意义。

结　果

一、不同前列腺细胞株的增殖情况比较

与RWPE-1细胞株相比，前列腺癌LNCaP细胞株、前列腺癌PC-3细胞株、前列腺癌DU145细胞株的细胞增殖能力明显增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的增殖能力依次递增，组间两两比较均有统计学差异（P＜0.05），见表1。

二、不同前列腺细胞株的迁移情况分析

与RWPE-1细胞株相比，前列腺癌LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株的迁移距离明显增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的侵袭和迁移能力依次递增，组间两两比较均有统计学差异（P＜0.05），见表2、图1。

表11　不同前列腺细胞株的增殖情况

表22　不同种前列腺细胞株2244hh迁移距离

图11　不同前列腺细胞株迁移能力（×200）A：DU-145细胞株；B：PC-3细胞株；C：LNCaP细胞株；D：RWPE-1细胞株

三、不同前列腺细胞株的侵袭能力

与RWPE-1细胞株相比，在Transwell小室侵袭和迁移实验中，前列腺癌LNCaP细胞株、前列腺癌PC-3细胞株、前列腺癌DU145细胞株的侵袭和迁移能力明显增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的侵袭和迁移能力依次递增，组间两两比较有统计学差异（P＜0.05），见表3、图2。

表33　比较不同前列腺细胞株的侵袭能力（xx±ss）

图22　不同前列腺细胞株的侵袭能力（×200）A：DU-145细胞株；B：PC-3细胞株；C：LNCaP细胞株；D：RWPE-1细胞株

四、Talin-1 mmRRNNAA在不同前列腺细胞株中的表达水平

与RWPE-1细胞株相比，前列腺癌LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株中的Talin-1 mRNA表达水平有差异（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的Talin-1 mRNA表达水平依次递增，组间两两比较有统计学差异（P＜0.05），见表4、图3。

表44　不同前列腺细胞株中Talin-1 mmRRNNAA表达水平（xx±ss）

图33　不同前列腺细胞株中Talin-1 mmRRNNAA扩增和溶解曲线

五、Talliinn--11在不同前列腺细胞株中的表达水平

与RWPE-1细胞株相比，在前列腺癌LNCaP细胞株、前列腺癌PC-3细胞株、前列腺癌DU145细胞株中的Talin-1蛋白表达水平有差异（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的Talin-1蛋白表达水平依次递增，组间两两比较有统计学差异（P＜0.05），见表5、图4。

表55　不同前列腺细胞株中Talliinn--11的蛋白表达水平（xx±ss）

图44　不同前列腺细胞株中Talliinn--11蛋白印迹图

讨　论

Talin-1广泛存在于哺乳动物细胞中，可与多种黏附分子和肌动蛋白相结合，诱发细胞骨架重构，导致细胞黏附和迁移。Talin-1与β-整合素结合后招募整合素连接激酶（Integrin-linked-kinase，ILK）和FAK并激活下游信号，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成［9］。

研究表明Talin-1在肿瘤转移中发挥重要作用。Fang等［10］认为Talin-1与人肝细胞癌转移和侵袭能力显著相关，可作为肝细胞癌诊断和治疗重要分子靶标。Bostanci 等［11］发现结肠癌患者术前血清样本Talin-1水平比正常人显著增高，并且与结肠癌分级、分期、淋巴结转移情况密切相关。Lai等［12］发现Talin-1高表达是口腔鳞状细胞癌不良预后的主要因素，敲除tain-1相关基因后可减弱口腔鳞癌细胞株增殖和侵袭能力。Xing等［13］发现Talin-1抗体或反义RNA可抑制Talin-1与β-整合素间相互作用，并破坏子宫颈癌细胞（Hela细胞）及成纤维素细胞应力纤维，导致细胞黏附、伸展以及迁移能力降低。Zhang等［9］发现Talin-1在前列腺癌细胞株中高表达，并且与侵袭力成正相关，靶向抑制Talin-1表达后，前列腺癌细胞迁移、侵袭能力下降。Sakamoto等［14］同样发现Talin-1在前列腺癌细胞中过度表达，通过激活生存信号和产生抗失巢凋亡来增强前列腺癌细胞黏附，迁移和侵袭。

本研究通过体外培养不同人前列腺癌细胞株（DU-145、PC-3、LNCaP细胞株）及人正常前列腺上皮细胞株（RWPE-1）发现：前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力明显高于人正常前列腺上皮细胞，并且在前列腺癌三组不同细胞株中，随着肿瘤恶性度增高，其增殖、侵袭和迁移能力也逐渐升高。通过分析不同前列腺细胞株中Talin-1 mRNA和Talin-1蛋白表达水平发现， RWPE-1、LNCaP、PC-3及DU-145细胞株中，Talin-1 mRNA和Talin-1蛋白表达水平依次递增，由此推测Talin-1与前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力可能相关，低表达Talin-1的前列腺癌增殖、侵袭和迁移能力低，恶性度低；高表达Talin-1的前列腺癌侵袭和迁移能力高，恶性度高。本研究是初步研究，Talin-1影响细胞迁移和侵袭的具体作用机制和调控尚未明确，有待进一步探讨。

参 考 文 献

1 Siegel R， Ma J， Zou Z， et al. Cancer statistics， 2014. CA Cancer J Clin 2014； 64（1）： 9-29

2 薛学义， 高锐， 许宁， 等. 福州市PSA异常的老年男性前列腺疾病跟踪调查与分析. 中国男科学杂志2009；23（1）： 48-50， 54

3 许宁， 薛学义， 李晓东， 等. 超声引导下经直肠前列腺饱和穿刺在首次活检阴性人群中的诊断价值. 中国介入影像与治疗学 2012； 9（9）： 648-651

4 Jin JK， Dayyani F， Gallick GE. Steps in prostate cancer progression that lead to bone metastasis. Int J Cancer 2011； 128（11）： 2545-2561

5 魏勇， 林峰， 许宁， 等. 转移性雄激素非依赖性前列腺癌患者生存预后研究. 中华实验外科杂志 2014； 31（10）：2323-2325

6 Desiniotis A， Kyprianou N. Signifi cance of Talin in cancer progression and metastasis. Int Rev Cell Mol Biol 2011；289： 117-147

7 Xu YF， Ren XY， Li YQ， et al. High expression of Talin-1 is associated with poor prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma. BMC Cancer 2015； 15： 332

8 Jin JK， Tien PC， Cheng CJ， et al. Talin1 phosphorylation activates β1 integrins： a novel mechanism to promote prostate cancer bone metastasis. Oncogene 2015； 34（14）：1811-1821

9 Zhang W， Mao YQ， Wang H， et al. MiR-124 suppresses cell motility and adhesion by targeting Talin 1 in prostate cancer cells. Cancer Cell Int 2015； 15： 49

10 Fang KP， Dai W， Ren YH， et al. Both Talin-1 and Talin-2 correlate with malignancy potential of the human hepatocellular carcinoma MHCC-97 L cell. BMC Cancer 2016； 16（1）： 45

11 Bostanci O， Kemik O， Kemik A， et al. A novel screening test for colon cancer： Talin-1. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2014； 18（17）： 2533-2537

12 Lai MT， Hua CH， Tsai MH， et al. Talin-1 overexpression defines high risk for aggressive oral squamous cell carcinoma and promotes cancer metastasis. J Pathol 2011；224（3）： 367-376

13 Xing B， Thuppal S， Jedsadayanmata A， et al. TA205， an anti-Talin monoclonal antibody， inhibits integrin-Talin interaction. FEBS Lett 2006； 580（8）： 2027-2032

14 Sakamoto S， McCann RO， Dhir R， et al. Talin1 promotes tumor invasion and metastasis via focal adhesion signaling and anoikis resistance. Cancer Res 2010； 70（5）：1885-1895

（2016-02-18收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.004

中图分类号R 737.25

*基金项目资助：福建省自然科学基金资助项目（2015J01393）；福建省创新基金资助项目（2014-CX-20）**通讯作者，E-mail：urologyfujian@163.com

The expression of Talin-1 is correlated with increased invasion and migration in different prostate cancer cells*

Chen Huijun△， Xu Ning△， Chen Shaohao， Chen Jintian，Li Xiaodong， Cai Hai， Xue Xueyi ， Wei Yong**， Zheng Qingshui
Departments of Urology， The First Affi liated Hospital to Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China Corresponding author： Wei Yong， E-mail： urologyfujian@163.com

AbstractObjective To investigate the different expressions of Talin-1 in different prostate cancer cells and its signifi cance in invasive and migration. Methods：Human prostate cancer cells （DU-145， PC-3， LNCaP） and normal human prostate epithelial cell RWPE-1 were cultured， and their proliferation， migration and invasion ability were measured by MTT， would healing assay and boyden chamber assay， respectively. The mRNA and protein expressions of Talin-1 were detected by real-time PCR and western blot， respectively. RessuullttssCompared with those of RWPE-1 cells， proliferation，invasion and migration of three prostate cancer cells were all signifi cantly enhanced （P＜0.05）. The proliferation， invasion and migration abilities of LNCaP， PC-3 and DU-145 cells were gradually increased in turn （P＜0.05）. The mRNA and protein expressions of Talin-1 in prostate cancer cells were obviously higher than that in normal human prostate epithelial cells （P＜0.05）. The mRNA and protein expressions of Talin-1 in LNCaP， PC-3 and DU-145 cells were elevated gradually in turn （P＜0.05）. ConcluussiioonnExpression level of Talin-1 may be associated with the proliferation， invasion and migration of prostate cancer cells. Talin-1 could serve as a predictor of malignant degree of prostate cancer．

Key wordsprostatic neoplasms；cytoskeletal proteins；neoplasm invasiveness