PAEs类化合物对雄性小鼠的联合致毒作用

葛　建，胡华军，林　芳，伍义行，邓同乐，张永勇

(中国计量大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018)

PAEs类化合物对雄性小鼠的联合致毒作用

葛建，胡华军*，林芳，伍义行，邓同乐，张永勇

(中国计量大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018)

摘要：为了探讨邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters， PAEs)类化合物的联合毒性作用，将6种PAEs类化合物配制成等质量比的混合物，以低、中、高剂量(40，400，4 000 mg·kg-1)对雄性小鼠灌胃染毒，观察雄性小鼠骨髓微核形成、精子畸形、血清及肝脏、睾丸等指征的变化，并与相同剂量处理的单一邻苯二甲酸二丁酯(DBP)组进行比较，以评价混合PAEs组的联合毒性作用。结果显示：高剂量处理时，混合PAEs组的雄性小鼠骨髓微核率及精子畸形率显著高于单一DBP组；中剂量处理时，混合PAEs组染毒雄性小鼠30 d后的肝损伤及睾丸组织损伤程度也较单一DBP组明显上升，表明混合PAEs组对雄性小鼠的联合致毒作用较单一DBP组显著，不同PAEs类化合物间可能存在一定的协同效应。

关键词：PAEs类化合物；雄性小鼠；骨髓微核率；精子畸形率；联合毒性

邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters，简称PAEs，别名酞酸酯)俗称塑化剂或增塑剂，主要用于塑料增塑剂、农药、涂料、印染、化妆品、油漆等领域的生产。PAEs以非共价键的形式与聚烯烃类塑料分子相结合，彼此保留各自独立的化学性质，较易缓慢向环境中释放[1-5]。近年来研究发现，不同PAEs 类化合物对人及动物存在潜在毒性作用。美国国家环保局(EPA)已将邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)等6 种PAEs列入重点控制的污染物名单中[6]。我国优先污染物黑名单中也列出了包括DMP 和DBP 在内的3种PAEs类化合物[7]。目前，国内外关于PAEs类化合物毒性的研究，大多集中于单一化合物的毒性[8-12]，环境中往往是多种PAEs类化合物以混合形式存在，而关于混合PAEs类化合物的毒性研究鲜见报道[13]，所以要考虑2种或更多种PAEs类化合物的联合毒性。为此，特选择DMP，DEP，DBP，BBP，DEHP及DPP这6种PAEs类化合物的混合物为对象，探讨混合PAEs类化合物的联合毒性作用。

1材料与方法

1.1试验材料

雄性小鼠(ICR)购自杭州师范大学实验动物中心；苏木素、伊红购自珠海贝索生物技术有限公司；Giemsa染料购自上海生工生物工程有限公司；量子点QD610线粒体膜透化检测试剂购自杭州杏之林生物技术有限公司；环磷酰胺(CP)购自上海第二制药厂；邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)购自上海百灵威科技有限公司。混合PAEs类化合物配制方法即按等质量混合以上6种PAEs类化合物。全波长荧光分光光度计购自Molecular Devices；光学显微镜购自Nikon。

1.2雄性小鼠骨髓微核率测定

取体重约20 g的雄性小鼠90只，随机分成9组，每组10只。包括：混合PAEs低、中、高剂量组(40，400，4 000 mg·kg-1)，单一DBP低、中、高剂量组(40，400，4 000 mg·kg-1)，阳性对照组(CP)，空白组(植物油)和正常组。各剂量混合PAEs组和DBP组每日1次灌胃染毒，连续4 d，CP组于第3，4天每日1次腹腔注射CP(40 mg·kg-1)，空白组灌胃植物油。第5天，将小鼠脱颈处死，取其两侧股骨骨髓，制细胞涂片。经姬姆萨氏染色后，镜检。嗜多染红细胞(PCE) 呈灰蓝色，成熟正染红细胞(NCE)呈红色。每张玻片需计数1 000个PCE，并计算含微核的PCE数，取其平均值，在一个PCE中出现2个或多个微核，仍按1个微核细胞计算。微核率按下式计算，并以千分率表示，嗜多染红细胞微核率(‰)=含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞总数×1 000。

1.3雄性小鼠精子畸形率测定

另取体质量约20 g的雄性小鼠90只，分组方法同1.2节。各剂量灌胃染毒组每日1次染毒，连续5 d，CP组于第4，5天每日1次腹腔注射CP(40 mg·kg-1)，空白组灌胃植物油。各组染毒后再正常饲养30 d，将小鼠脱颈处死，取出其双侧附睾放入盛有生理盐水的离心管中，取精子制成涂片，染色后显微镜观察。每只雄性小鼠观察1 000个精子，按Wyrobeks的分类标准统计畸形率[14]。

1.4雄性小鼠30天染毒试验

另取体重约20 g的雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只。由于混合PAEs或单一DBP高剂量连续灌胃1周以上有小鼠死亡现象，而低剂量毒性弱，因此，选择中剂量作为30 d染毒灌胃剂量。分组包括：混合PAEs中剂量组(400 mg·kg-1)，单一DBP中剂量组(400 mg·kg-1)，空白组(植物油)，正常组。每日1次灌胃染毒连续30 d后，眼球取血，分离得到血清，测定其睾酮(T)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。同时取肝脏组织和睾丸组织备用。

1.5肝细胞线粒体膜透化检测

将1.4节取材的部分肝组织按梯度差速离心法分离肝组织线粒体，按0.5 mg·kg-1重悬于测定缓冲液(含225 mmol·mL-1甘露醇、70 mmol·mL-1蔗糖、5 mmol·mL-1Hepes，pH 7.2)中，在室温条件下，分别与线粒体膜透化检测试剂量子点QD610共孵10 min后，选取激发波长350 nm、发射波长610 nm，用荧光分光光度计测定各组线粒体悬液的荧光强度。

1.6肝组织、睾丸组织HE染色

将1.4节取材的肝脏组织和睾丸组织进行固定，然后依次经过体积分数为85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅲ、95%乙醇Ⅳ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ中进行脱水，脱水后进行石蜡包埋、切片，HE染色观察组织结构。

1.7数据处理与统计分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，结果以平均值±标准差表示，2组之间显著性分析采用配对t检验，P<0.05为显著差异，P<0.01 为极显著差异。

2结果与分析

2.1雄性小鼠骨髓PCE细胞微核率

由表1可见，各组PCE与NCE的比值均为0.6～1.2，代表PCE形成未因染毒而抑制，试验结果可靠[14]。经染毒后小鼠骨髓PCE细胞微核率均提高，混合PAEs高剂量组与空白组比较存在极显著差异(P<0.01)，且混合PAEs高剂量组微核率也极显著高于单一DBP高剂量组(P<0.01)，说明高剂量混合PAEs类化合物遗传毒性高于单一DBP。

2.2雄性小鼠精子畸形率

结果显示：各剂量染毒组精子畸形率均高于空白组(13.6±2.16)‰，且混合PAEs高剂量组精子畸变率(60.6±6.86)‰与单一DBP高剂量组(42.0±4.20)‰比较，存在极显著差异(P<0.01)，说明高剂量的混合PAEs类化合物生殖毒性高于单一DBP。

表1小鼠骨髓微核率及PCE与NCE的比值

Table 1Result of mice micronucleus test and PCE/NCE

组别PCE/NCE微核率/‰正常组0.95±0.013.17±0.98E空白组0.94±0.023.67±1.03DE单一DBP低剂量组0.92±0.023.65±0.88DE单一DBP中剂量组0.89±0.014.32±1.06DE单一DBP高剂量组0.83±0.017.17±0.98C混合PAEs低剂量组0.88±0.014.67±1.21DE混合PAEs中剂量组0.79±0.015.33±1.21D混合PAEs高剂量组0.85±0.0112.83±2.14B环磷酰胺毒性对照组0.83±0.0116.50±2.59A

注：同列数值后无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

2.3雄性小鼠肝线粒体的膜透化程度

混合PAEs中剂量组相对荧光强度显著高于空白组和单一DBP中剂量组(P<0.05)(图1)。荧光强度越高，显示线粒体膜透化越严重，即反映出肝细胞的损伤程度。由于肝脏是机体的重要解毒器官，且具有较强的自我修复能力，30 d染毒中剂量混合PAEs组和单一DBP组间没有极显著差异，但该结果也表明，中剂量混合PAEs类化合物对雄性小鼠肝损伤作用要比相同剂量单一DBP作用强。

无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1　小鼠肝脏线粒体相对荧光强度Fig.1　The relative fluorescence values of mice liver mitochondrial

2.4雄性小鼠血清睾酮及转氨酶含量的变化

雄性小鼠血清中T,ALT,AST含量均高于空白组，且混合PAEs中剂量组和单一DBP中剂量组比较存在极显著差异(P<0.01)(表2)。该结果表明，中剂量混合PAEs类化合物染毒对雄性小鼠肝功能和分泌睾酮激素的影响较DBP明显。

2.5小鼠肝脏、睾丸组织结构特征

如图2所示，空白组与正常组小鼠肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，胞核及胞质未见明显异常。混合PAEs中剂量组和单一DBP中剂量组肝组织均有不同程度损伤，前者肝小叶结构部分破坏，细胞排列紊乱，部分细胞有空泡，胞质染色变浅，核浆边缘不清，后者肝小叶结构相对完整，但细胞排列松散。空白组与正常组小鼠生精细胞呈圆形或卵圆形，细胞间排列整齐，大小均等，致密度高，而染毒组中曲细精管结构紊乱，生精细胞、次级精母细胞从生精上皮脱落明显，其中混合PAEs中剂量组比单一DBP中剂量组睾丸组织损伤严重(图3)。

表2各组血清中的T，ALT，AST含量

Table 2Concentrations of T， ALT， AST in serum

组别T/(nmol·L-1)ALT/(1×16.67nkat·L-1)AST/(1×16.67nkat·L-1)正常组1.07±0.53B19.68±6.29C98.27±15.64C空白组2.86±1.86B21.37±9.31C103.89±28.53C单一DBP中剂量组5.26±3.89B137.21±67.25B257.57±34.95B混合PAEs中剂量组24.36±8.84A274.41±34.91A418.21±106.44A

A： 空白组；B： 正常组；C： DBP中剂量组；D：混合PAEs中剂量组。400×。图3同。图2　肝脏组织HE染色Fig.2　HE stain of liver

图3　睾丸组织HE染色Fig.3　HE stain of testis

3讨论

环境激素又称环境内分泌干扰物，是环境污染物中的一个大类，主要包括人工合成和工业排放的持久性有机污染物，如有机农药、多氯联苯以及塑化剂类等。现代动物毒理学研究也发现，溴系阻燃剂(BFRs)由于在土壤、沉积物、大气以及生物体内的广泛暴露，对水生动物、鸟类、哺乳类动物均存在不同程度的毒性[15]。目前，毒理学领域关于农药的研究尚未开展环境内分泌干扰方面的研究，仅对非靶标动物(如鱼、蜜蜂、蚯蚓、蛙类等)相关毒性研究进行评估[16]。本研究以自然环境暴露最常见的DMP，DEP，DBP，BBP，DEHP及DPP等6种PAEs化合物等质量比组成的混合物为研究对象，着重开展了其联合毒性研究。结果显示，混合PAEs化合物相比单一DBP在4 000 mg·kg-1染毒剂量条件下，小鼠的骨髓微核率和精子畸形率明显升高。同时也发现，混合PAEs化合物在400 mg·kg-1剂量条件30 d染毒后血清中ALT，AST活性升高，肝线粒体膜透化增加，肝组织结构异常，其对肝所致联合毒性比相同剂量DBP单一毒性要强。由于试验中混合PAEs类化合物和单一DBP对雄性小鼠染毒剂量均相同，而混合形式对雄性小鼠的联合致毒作用较单一作用强。因此，不同PAEs类化合物间可能存在一定的协同效应，至于不同PAEs所致机体联合毒性的深层次分子机制有待于进一步探索。

课题组前期研究也发现，PAEs类化合物或其代谢产物易于在动物体内蓄积[17-19]。被摄入机体后致肝损伤，使得机体代谢异常，更进一步抑制了肝代谢功能，导致内源性代谢紊乱，以致引起体内类固醇激素代谢紊乱，从而表现出一系列生殖内分泌相关毒性[20]，包括睾酮水平的明显改变，最后导致生精细胞发育过程阻滞和出现凋亡，这与小鼠睾丸组织的HE染色结果基本一致。有关DBP生殖毒性的研究报道表明，其导致生殖毒性的主要机制为DBP代谢产物对睾丸间质细胞胆固醇转运蛋白表达有显著抑制作用[21]。因此，混合PAEs中每种化合物毒性机制以及协同毒性尚需进一步研究。

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(责任编辑卢福庄)

Study on synergistic toxicity of phthalic acid esters chemicals in male mice

GE Jian， HU Hua-jun*， LIN Fang， WU Yi-hang， DENG Tong-le， ZHANG Yong-yong

(CollegeofLifeSciences，ChinaJiliangUniversity，Hangzhou310018，China)

Abstract:In order to explore the synergistic toxicity of phthalate acid esters (PAEs)， the bone marrow micronucleus formation， sperm deformity， liver and testis damage were carefully observed and determined on male mice， which were exposed to mixed PAEs chemicals with different levels of dose (40， 400， 4 000 mg·kg-1) and single dibutyl phthalate (DBP) with the same doses (40， 400， 4 000 mg·kg-1). It was shown that the bone marrow micronucleus formation rate and sperm deformity rate were obviously higher in the mixed group with high-dose (4 000 mg·kg-1) PAEs than those in the single DBP treatment. Besides， the damage of liver and testis was also higher in the mixed group with moderate-dose (400 mg·kg-1) PAEs than that in the single DBP treatment after 30 d. As mentioned above， the mixed PAEs exhibited more severe toxic effects than single DBP treatment， which suggested that there might be certain synergistic effect among PAEs chemicals.

Key words:PAEs chemicals; male mice; bone marrow micronucleus formation rate; sperm deformity rate; synergistic toxicity

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.07

收稿日期：2015-09-26

基金项目：浙江省分析测试科技计划项目(2013C37056)

作者简介：葛建(1979—)，男，安徽蚌埠人，博士，副教授，研究方向为药物毒理学。E-mail: gejian@cjlu.edu.cn

*通信作者，胡华军，E-mail: hhj@cjlu.edu.cn

中图分类号：S859.8；X503

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0753-05

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 753-757

http://www.zjnyxb.cn

葛建，胡华军，林芳，等. PAEs类化合物对雄性小鼠的联合致毒作用 [J].浙江农业学报，2016，28(5): 753-757.