清肺通络膏对呼吸道合胞病毒感染大鼠肺组织PI3K-AKT-NFκB信号通路的影响

刘小雪，　王雪峰，　张秀英，　王艺欢，　王思源，　南春红

110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生学院(刘小雪，张秀英，王艺欢)；辽宁中医药大学附属医院儿科(王雪峰，王思源，南春红)



实验论著

清肺通络膏对呼吸道合胞病毒感染大鼠肺组织PI3K-AKT-NFκB信号通路的影响

刘小雪，王雪峰，张秀英，王艺欢，王思源，南春红

110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生学院(刘小雪，张秀英，王艺欢)；辽宁中医药大学附属医院儿科(王雪峰，王思源，南春红)

【摘要】目的观察清肺通络膏对呼吸道合胞病毒(RSV)感染大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达的影响，探讨清肺通络膏对PI3K/AKT/NF-κB信号通路的调控机制。方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组各10只，模型组、治疗组均给予RSV滴鼻接种3 d，治疗组于接毒第1天予清肺通络膏背部贴敷，连续7 d。于造模第7天后取大鼠肺组织，运用免疫组织化学染色法检测各组大鼠肺组织中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表达。结果与正常组比较，模型组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论RSV感染大鼠时激活了PI3K/AKT/NF-κB信号通路，清肺通络膏能够抑制PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表达，可能是清肺通络膏干预RSV肺炎的机制之一。

【关键词】肺炎；呼吸道合胞病毒；清肺通络膏；PI3K/AKT/NF-κB信号通路；大鼠

呼吸道合胞病毒(respreatory syncytial virus，RSV)是一种RNA病毒，属副黏液病毒科，是导致婴幼儿患病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一[1]。中医药治疗病毒性感染疾病独具优势，疗效确切，耐药性低，不良反应少，临床实践中发现，采用中药外敷治疗RSV肺炎患儿，不仅疗效显著，而且解决了婴幼儿给药困难、家长不易接受等问题。清肺通络膏是根据辽宁中医药大学附属医院院内制剂敷胸散改良而来，主要组成为大黄、黄芩、大蒜，寒热兼顾、升降相宜。现代研究证明，大黄对流感病毒、呼吸道合胞病毒等十几种对人类危害极大的病毒有显著的抑制作用[2]；黄芩有抗病毒、抗菌、抗氧化等多方面的药理作用[3]；大蒜也具有抗菌、抗病毒生物活性[4]。王雪峰教授多年临床实践发现清肺通络膏对多种小儿呼吸道疾病有明显疗效，但对其作用机制尚不明确，为进一步探讨该临床有效复方的作用机制，本实验采用免疫组化法，观察清肺通络膏对RSV感染大鼠肺组织中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表达的影响，为清肺通络膏的临床应用提供更有利的理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量60～80 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。

1.2细胞与病毒人喉癌上皮细胞(Hep-2细胞)，由辽宁中医药大学附属医院病毒实验室提供；RSV(long株)，购自于中国预防医学科学院病毒所毒种室，保存在辽宁中医药大学附属医院病毒室液氮罐中。

1.3实验药品及清肺通络膏制备大黄、黄芩均购自辽宁中医药大学附属医院中药房，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定均为正品。清肺通络膏制备，大黄∶黄芩=1∶1，采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2 h，合并滤液，减压干燥研成粉末，避光冷藏。于给药前用大蒜汁将干燥粉末调成膏状备用。

1.4主要试剂一抗：兔抗PI3K多克隆抗体(批号：ab151549，购自Abcam公司)、兔抗AKT1/2多克隆抗体(批号：ab6076，购自Abcam公司)，兔抗NF-κBp65抗体(批号：bs-0465R，购自北京博奥森生物技术有限公司)，SP免疫组化检测试剂盒(批号：AD0807，购自北京博奥森生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(批号：15111A06，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.5主要设备IP1020型自动组织脱水处理机、Autostainer XL型自动组织染色机、EG1105型石蜡包埋机、A020221型烘漂处理仪、RM2135型精密转轮切片机(上海徕卡仪器有限公司)，BX50F4型系统生物显微镜(OLYMPUS)，计算机图像分析仪(北京航空大学图像中心)。

1.6实验方法

1.6.1分组、造模及给药将30只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、治疗组各10只。将全部大鼠置于SPF级清洁笼内喂养，3 d后开始正式实验。正常组经鼻滴加生理盐水0.1 mL，其余两组鼻腔接种RSV原毒液0.1 mL，连续3 d。接毒第1天，治疗组大鼠给予脱毛处理，使大鼠背部皮肤充分暴露，脱毛面积约2 cm×2 cm大小，并给予清肺通络膏背部外敷治疗，生药量每次0.6 g，每日1次，连续敷药7 d进行干预。正常组和模型组不予干预。

1.6.2标本取材及指标测定各组大鼠于造模第7天后取材，取材前8 h禁食水。断髓处死各组大鼠，无菌开胸，取出肺脏，生理盐水冲洗干净后于4%多聚甲醛固定，固定完全后脱水、包埋、切片。按SP免疫组化检测试剂盒操作说明书上的检测步骤进行大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65的测定。显微镜观察，每张切片任选5个视野(×200)，采用北航分析系统图像采集，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统分析、测定每个肺组织的阳性颗粒(棕黄色)的平均光密度。

2结果

各组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达结果见表1、图1～3(见封三)。从图1～3可以看出，正常组、模型组、治疗组各组大鼠肺组织免疫组化染色后均可观察到肺组织中存在棕黄色阳性颗粒，说明各组大鼠肺组织中蛋白PI3K、AKT1/2、NF-κB p65均有表达。

表1　各组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

分析各组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白平均光密度，从表1可知，模型组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达最强，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

RSV感染是造成婴儿期住院的常见病原，首次感染多见于1岁以内的婴儿，感染率高，深圳市龙岗区妇幼保健院2012年3月至2013年3月儿科收治住院的急性下呼吸道感染患儿病毒阳性标本中，呼吸道合胞病毒阳性率最高，为47.00%[5]，并且与支气管哮喘的发生和发展关系密切[6]。小儿RSV肺炎属于中医的“肺炎喘嗽”范畴。小儿脏腑娇嫩，形气未充，肺常不足，卫外不固，由口鼻或皮毛感受六淫邪气，致肺失宣肃，肺气郁闭，郁久化热，导致肺炎喘嗽发生。王雪峰教授结合临床实践经验和小儿肺炎的病因病机提出了“从肺毒热论治”的理论[7]，在小儿肺炎实热证阶段尽早使用入肺经的清热解毒药；又因肺与大肠相表里，肺之毒热易移大肠，所以将清热解毒、泻下等药物配伍后外敷于背部肺俞、膏肓等穴位，既可清肺之毒热又可通导大肠，使毒热之邪得出路而解。小儿肺炎实热证阶段采用清肺通络膏外敷，药物经皮透入，经腧穴由表入里，循经络内达脏腑，达到内病外治的效果。清肺通络膏的君臣药为大黄、黄芩，大黄归胃、大肠、肝、脾经，泻下攻积，清热泻火，具有荡涤胃肠实热积滞的作用；黄芩归肺、胆、脾、大肠、小肠经，清热燥湿，泻火解毒，长于清除中上二焦湿热；佐以大蒜，大蒜药性辛温，解毒杀虫，制约大黄及黄芩的苦寒之性，全方配伍简明扼要、寒热兼顾、升降相宜。

本研究中，采用RSV(long株)经鼻腔接种SD大鼠，建立大鼠RSV肺炎模型。模型组与正常组比较，模型组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表达均上调，说明RSV感染大鼠后存在PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活。许多研究表明，PI3K能够影响气道平滑肌细胞的增殖，干预Th2细胞、B细胞及嗜酸性粒细胞的炎症反应过程[8]。RSV感染机体后，上调S1P(sphingosine1-phosphate)，进而介导PI3K-Akt信号通路的激活[9]，一旦PI3K-Akt信号通路被抑制，RSV诱导的细胞凋亡就会大量发生[10]。PI3K是由一个p110催化亚基和一个p85调节亚基组成的异源二聚体，能将PIP2磷酸化成PIP3。PIP3可以将具有PH结构域的信号分子(如Akt)招募到质膜上进行活化，进而启动下游信号通路[11]。Akt是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，具有丝-苏氨酸激酶活性。活化的Akt能够通过活化IKK使IκB磷酸化，从而使NF-κB从IκB/NF-κB复合物中解离下来重新恢复NF-κB的转录激活活性[12]。

本实验结果显示，治疗组大鼠肺组织PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表达均较模型组低，说明清肺通络膏对RSV感染大鼠发挥一定的治疗作用，其作用机制可能就是抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活。本实验仅从蛋白水平观察了RSV感染后PI3K/AKT/NF-κB信号通路的情况及清肺通络膏对PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表达的影响，进一步还可以从分子水平进行研究。

参考文献

[1]Harris J，Werling D.Binding and entry of respiratory syncytial virus into host cells and initiation of the innate immune response[J].Cell Microbio，2003，5(10):671-680.

[2]杨宏博,冯平,李宝才.大黄抗病毒作用的研究进展[J].华西药学杂志，2009，24(4):428-430.

[3]张瑜,武斌,许建卫.黄芩药理作用的研究进展[J].医学综述,2013,19(6):1091-1093.

[4]马丽娜,李峰杰,陈坚,等.大蒜主要活性成分及药理作用研究进展[J].中国药理学通报，2014，30(6):760-763.

[5]张旭光,卢仕仰,黄从付,等.儿童急性下呼吸道感染2368例病原学分析[J].中国中西医结合儿科学,2014,6(6):543-544.

[6]Dawson-caswell M，Muncie HL Jr.Respiratory syncytial virus infection in children[J].Am Fam Physician，2011，83(2):141-146.

[7]王雪峰.从肺毒热论治小儿肺炎本脏重症[J].中医杂志，2012，53(3):200-202.

[8]Cantley LC.The phosphoinositide 3-kinase patliway.Science，2002，296(5573):1655-1657.

[9]Monick MM,Cameron K,Powers LS,et al.Sphingosine kinase mediates activation of extracellular signal-related kinase and Akt by respiratory syncytial virus[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2004，30(6)：844-852.

[10]Thomas KW,Monick MM,Staber JM,et al.Respiratory syncytial virus inhibits apoptosis and induces NF-kappa B activity through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway[J].J Biol Chem，2002，277(1)：492-501.

[11]Vivanco I，Sawyers CL.The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer[J].Nat Rev Cancer，2002，2(7):489-501.

[12]Chang F，Lee JT，Navolanic PM，et al.Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression，apoptosis，and neoplastic transformation:a target for cancer chemotherapy[J].Leukemia，2003，17(3):590-603.

(本文编辑：刘颖)

Effect of Qingfei Tongluo ointment on the PI3K/Akt/NF-kappaB signaling in rats infected with RSV

LIUXiaoxue,WANGXuefeng,ZHANGXiuying,WANGYihuan,WANGSiyuan,NANChunhong.

LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and the mechanism of Qingfei Tongluo ointment on the expression of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in rats infected with RSV.MethodsTotally 30 rats were randomized into 3 groups,namely,normal group,model group,treatment group,with 10 rats in each.The rats of the last two groups were made into RSV infection models.For treatment group Qingfei Tongluo ointment was given at the first day of the experiment,once daily for seven consecutive days.Examine the levels of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in lung tissue,using the method of immunohistochemistry.ResultsThe result of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 expression in lung tissue showed that：compared with the normal group，the model group had significant difference(P<0.05);compared with the model group，the treatment group had significant difference(P<0.05).ConclusionQingfei Tongluo ointment is an effective drug for external use in RSV infection;its action mechanism may be through adjusting the PI3K/Akt/NF-κB signaling.

【Keywords】Pneumonia;RSV;Qingfei Tongluo ointment;PI3K/Akt/NF-kappaB signaling;Rats

基金项目：国家自然科学基金项目(81273800)

作者简介：刘小雪(1988-)，女，辽宁中医药大学2013级硕士研究生在读。研究方向：病毒性疾病的中医药治疗通讯作者：王雪峰，E-mail：lnzywsf@163.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.02.004

【中图分类号】R725.6

【文献标识码】A

【文章编号】1674-3865(2016)02-0136-03

(收稿日期：2016-03-19)