贪婪算法在药材提取优化改良中的应用及其动力学模型探究

孙鹏，尹海波，常成栋，贾晓晴，邵飞

（1.沈阳市第七人民医院 药剂科，辽宁 沈阳 110003；2.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Maknio)的干燥根茎，又称为穿地龙、穿龙骨、地龙骨、常山等[1]。被收载于2015年版中国药典一部[2]。穿山龙中的甾体皂苷已经成为甾体类激素药物和抗冠心病皂苷类药物的重要原料[3]，其总皂苷在改善冠脉循环、抗动脉粥样硬化、预防心血管疾病等方面具有较强的药理活性。同时多糖（polysaccharide）类成分具有较强的抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、提高免疫力作用[4]。

贪婪算法（greedy method）是一种采用逐步构造最优解的方法。在每个阶段中都要作出一个看上去最优的决策（在一定的标准下），决策一旦作出，就不可再更改。作出贪婪决策的依据称为贪婪准则（greedy criterion）。研究发现该方法对药材有效成分提取率的提高具有十分重要的意义。

传统应用于穿山龙药材提取的方式是回流提取，大量文献资料显示超声对于中药多糖物质、皂苷类物质的提取具有促进作用。有人认为由于穿山龙饮片较坚硬，植物细胞不易破碎，用超声波法只能低限度地提取其中多糖，导致产品的获得率和纯度偏低[5-8]。本文依据贪婪算法，将超声处理引入到穿山龙活性成分的提取中，改进现有的提取方法，实验通过不同提取方式的对比加以验证并结合显微观察和植物学中的相关知识提出低功率下超声提取的动力模型，以此为基础进一步探究了超声强化回流提取应用在穿山龙活性成分提取中的理论依据。

1　贪婪算法

考察时间对两种活性成分提取率的影响，选取7个时间点进行实验，结果见表1，2。权重法处理得到贪婪算法的基础数据，结果见表3。对比每个时间段的数据，依据贪婪算法思路获得：先进行超声处15 min后改为回流提取的超声强化回流提取法为最佳提取方式。

表1　提取时间与多糖提取率的关系(n=7)

表2　提取时间与总皂苷提取率的关系(n=7)

表3　不同提取方法的提取率的变化加权值与时间

2　材料与方法

2.1　实验材料

穿山龙采自吉林省抚顺清原南山城镇，药材经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣（Dioscorea nipponica Makino）的干燥根茎，标本保存于辽宁中医药大学药用植物教研室。

2.2　仪器试剂

仪器：紫外可见分光光度计 (UV24802型)、CP225D电子天平(德国Sartorius公司)、显微镜、超声仪、恒温水浴锅、250 mL容量瓶、旋转蒸发仪等。

试剂：葡萄糖、浓硫酸、苯酚、高氯酸、乙醇(95%)、无水乙醇、氯仿等皆为分析纯，重蒸水。

2.3　线性关系考察

2.3.1多糖线性范围

干燥葡萄糖粉末至恒重，精密称取26.81 mg，配得葡萄糖标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶液0，5，10，15，20，25 mL 至 100 mL 容量瓶中稀释，取各浓度的标准液1.0 mL分别置于试管中显色，495 nm处测定其吸光度，以吸光度Y为纵坐标，葡萄糖含量X为横坐标绘制标准曲线Y=9.391×10-3X-3.571×10-2，相关系数 r=0.9994，线性范围为 13.46～67.24μg。

2.3.2总皂苷线性范围

精密称取薯蓣皂苷元对照品4.14 mg，配制成0.1656 mg/mL对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，挥干，显色，置25℃水浴保温25 min。以高氯酸为空白，在409 nm处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，总皂苷含量X为横坐标绘制标准曲线的线性方程Y=18.013×10-3X+1.4322×10-3，相关系数 r=0.9999，线性范围为 8.28μg～66.24μg。

2.4　供试品溶液的制备

依据贪婪算法中的基础数据设计实验，按照不同的实验方法对实验进行编号。实验Ⅰ：回流提取法（在90℃回流提取2 h的回流提取）；实验Ⅱ：超声提取法（室温恒温超声提取30 min）；实验Ⅲ：超声强化回流提取（先室温超声提取15 min再90℃回流提取1 h）；实验Ⅳ：回流辅助超声提取（先90℃回流提取1 h再室温超声提取15 min）；实验Ⅴ：耦合提取（回流提取装置于90℃超声场中进行提取）。

2.4.1多糖供试品制备

精密称取穿山龙药材粉末3.0 g（过40目筛），20倍体积75%乙醇，于150 mL圆底烧瓶中。分别采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ进行提取，过滤，残渣用75%乙醇10 mL洗涤2次，合并提取液和洗液，蒸干，测得浸膏质量。加适量体积蒸馏水加热溶解，过滤，残渣用10 mL蒸馏水洗涤2次，滤液于250 mL量瓶中定容。

2.4.2总皂苷供试品的制备

精密称取药材粉末3.0 g(过40目筛)，20倍体积75%乙醇置150 mL圆底烧瓶中，分别采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ进行提取，分别进行滤过，挥去溶剂，加一定量的浓度硫酸，超声处理3 min（促进溶解），加热回流，放冷，置分液漏斗中，再加三氯甲烷20 mL，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，用NaOH溶液洗至中性，减压回收溶剂至干。残渣加无水乙醇使溶解，转移至20 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5　含量与提取率的测定

2.5.1穿山龙多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法，吸取供试品溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。精密吸取1.0 mL至试管中，加1.0 mL 5%的苯酚溶液，摇匀，迅速加5.0 mL浓硫酸，摇匀后反应 15 min，置冷水中冷却10 min，同时用 1.0 mL蒸馏水进行平行操作作空白，在波长 495 nm处测定吸光度。

多糖提取率计算如下：

2.5.2穿山龙总皂苷含量测定

精密吸取0.05 mL供试品溶液于10 mL比色管中，挥干溶剂，加高氯酸5 mL，置25℃水浴中保温25 min，取出冷却至室温，以高氯酸为空白对照，测定吸光度，计算供试品中总皂苷提取率。

2.6　显微观察

从原药材粉末经5种不同提取方法提取后的粉末残渣中取出实验所用样品，分别标记为A，B，C，D，E，F；取原药材粉末（标记为G）进行对照观察。同时用5点取样法分别在6类样品中进行取样，每点精取 1.00 g， 标 记 为 Xi（X=A，B，C，D，E，F，G；i=1，2，3，4，5）分别过 80 目筛，称取所得粉末质量。将过筛后所得粉末用水合氯醛装片进行显微观察。

3　结果与分析

3.1　化学分析结果(表4)

表4　理化试验数据

3.2　显微实验结果

3.2.1视觉观察

发现超声强化回流提取的残渣中微细粉末最多。不同方法提取后的残渣较原粉末细微颗粒均有不同程度增加（图1）。

3.2.2显微观察

观察发现，几种提取方法所得粉末残渣中细胞的破碎程度不同，以超声强化回流提取的细胞破碎程度最为严重。低功率超声提取的残渣中成片状存在的薄壁细胞团数目与原药材粉末无显著差异，其它提取方法粉末残渣中成片存在的薄壁细胞团数目基本多于5个，而超声强化回流提取的残渣中成片状存在的薄壁细胞团较少，成片状存在的薄壁细胞团多数情况下不足5个。说明超声提取和回流提取的破壁效果都不太理想；超声强化回流提取对粉末颗粒的破壁效果最明显（图2）。

图1　几种方法粉末残渣直观图A回流提取的粉末残渣；B超声提取的粉末残渣；C超声强化回流提取的粉末残渣；D回流辅助超声提取的粉末残渣；E超声耦合回流提取粉末；F原药材粉末

图2　几种方法粉末残渣显微图A回流提取的粉末残渣切片；B超声提取的粉末残渣切片；C超声强化回流提取的粉末残渣切片；D回流辅助超声提取的粉末残渣切片；E超声耦合回流提取的粉末切片；F原药材粉末切片

3.2.3定量分析

定量分析结果显示超声强化回流提取的残渣中可过80目筛的粉末重量远远高于其他提取方法，超声强化回流提取的粉末残渣中颗粒较细（图3）。

4.提取模型建立及验证

图3　不同提取方法破壁率定量示意图

σ0为超声前的颗粒力度，t为提取时间，为常量则低功率超声条件下的中草药浸提模型为：

对于确定的药材，α，β均为常数，K为二阶浸出速率常数 g·(mL·min)-1。

低功率超声提取与回流提取交叉应用的提取模型为：

x，y为矢量，与提取条件有关，x≥y与x＜y可表示不同的提取方式：x≥y表示优先进行超声处理，x＜y表示优先进行回流处理；z为标量，与药材、目标成分等的性质有关。

D为扩散系数，与扩散体系的物质性质、温度以及扩散面处的物质浓度等因素有关。

ca为溶出饱和度，即饱和时该有效成分的浓度g·mL-1；c1为t时间溶液中该有效成分浓度g·mL-1。颗粒数目ω、溶剂的倍量M。

将表4中实验数据代入交叉提取模型中均出现：当存在x＞y时可以得到函数的最优解集。

因此对于穿山龙活性成分提取的最佳提取方式为超声强化回流提取。

5　实验结果解析

理化实验结果显示：在对穿山龙活性成分提取中超声强化回流提取在明显缩短了提取时间的同时，又明显提高了活性成分提取率，超声强化回流的提取效果优于其他提取方法。

显微实验结果显示，超声强化回流提取的破壁率明显高于其余提取方法，为模型建立时的理论基础提供了事实依据，证实了低功率超声提取模型的理论解释的正确性，进一步证实了贪婪算法应用于药材提取优化改良的可行性和合理性。

6　讨论

加热条件下不均匀介质中的声场会发生畸形变化，而畸形声场的存在使得现有的超声提取的动力学模型存在着很大的不足，对于提取方案按照NPC(non-deterministic polynomial complete)问题探究及以此建立的提取模型尚处于初级研究阶段；且中药中的植物药材的个体差异很大，暂无法对低功率超声强化回流提取的基本模型进一步优化。本实验以贪婪算法为指导以实验数据为基础，结合显微观察建立了新的提取模型理论，完成了低功率超声强化回流提取方法的初步研究，实现了对传统提取方式的改良优化，证实了贪婪算法在药材提取中应用的合理性。

实验结果与所建立的低功率超声提取模型计算结果以及贪婪算法的预测结果一致，模型作为提取动力学机理的拓展具有实际意义。超声强化回流提取，对穿山龙活性成分提取效果好于单一的回流提取，且提取时间短提取效率高，破壁率远好于单一的回流提取法。在穿山龙活性成分提取中超声强化回流提取是一种新的绿色高效的提取方法。贪婪算法在药材提取优化改良中具有可行性。