提高免疫组织化学反应的抗原修复技术

宋　容，肖　觉，刘　佳，李光新，林一民



提高免疫组织化学反应的抗原修复技术

宋容1，肖觉1，刘佳1，李光新1，林一民2△

[摘要]目的探讨不同抗原修复方法对免疫组织化学反应结果的影响，以提高免疫组织化学染色阳性率。方法分别采用3种不同抗原修复方法作预处理后，进行Envision免疫组织化学二步法检测10种常用抗体的免疫组织化学染色效果。结果石蜡组织切片，免疫组织化学反应的抗原修复方法预处理，采用高温高压抗原修复法，与微波抗原修复法及煮沸抗原修复法染色强度有明显差异，高温高压抗原修复法明显优于微波法及煮沸法。结论预处理采用高温高压抗原修复法，既可提高免疫组织化学反应阳性表达率，又能提高制片质量，可以一次性用于大量组织切片，是一种理想的免疫组织化学反应的抗原修复预处理方法。

[关键词]抗原修复法；组织预处理；免疫组织化学

免疫组织化学技术已成为病理科实验室的常规工作及科研工作中不可缺少的重要手段，广泛应用于临床病理诊断[1]，帮助评价肿瘤的增生程度和分期，对患者预后、治疗等方面起到了指导作用。但在日常工作中病理标本都用10%中性福尔马林液固定，经过10%中性福尔马林液固定的石蜡组织，会产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原，阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联，使被封闭的抗原充分暴露[2]，抗原修复技术在免疫组织化学染色过程中成为一个极其重要的环节[3]。不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学反应结果的表达，正确应用抗原修复技术在免疫组织化学反应实验中有着重要作用，常用的抗原修复技术有高温高压抗原修复法、微波抗原修复法、煮沸抗原修复法3种方法[4]，作者将3种方法进行比较，探讨高温高压抗原修复法对提高免疫组织化学反应结果的影响，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料收集本研究所病理科2013～2014年25份肿瘤组织标本(其中乳腺癌5份；胃癌5份；淋巴结5份；直肠癌5份；血管瘤5份)，用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，3 μm厚，一式3份裱于经防脱处理的载玻片上(高温高压组、微波炉组、煮沸组)。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂(1)仪器：家用美的不锈钢电压力锅1个，内径24 cm,型号为PCA405；美的SNC家用微波炉1台，型号为KS2163；家用美的电磁炉1台，型号为RK2102，煮锅1个，内径24 cm。(2)试剂：实验选用Envision 2步染色法。一抗二抗、DAB试剂盒、0.01 mol/L柠檬酸缓冲溶液pH值6.0都购于北京中杉金桥生物技术有限公司。磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L pH值7.2～7.4)，自己配制。

1.2.2组织切片处理将石蜡组织切片裱于防脱玻片上，放在65 ℃烤片箱内过夜烤片，常规组织切片放入二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化后，用蒸馏水冲洗3次，然后放入3%H2O2(过氧化氢溶液)中浸泡10 min，灭活內源性的过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗3次，PBS液洗3×3 min，进行3种抗原预处理。

表1　10种抗体采用3种抗原修复法免疫组织化学标记阳性的表达情况(n=25)

/：此项无表达。

1.2.3高温高压抗原修复法将组织切片脱蜡入水后，抗原修复液0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入电压力锅内，组织切片置于耐高温塑料切片架上，轻轻放入电压力锅内，组织切片必须位于液面下，盖紧锅压阀，插上电源，将定时器调到6小格上，每小格30 s，当电压力锅喷气后维持2 min，这时电压力锅的红灯变成绿灯，关闭电源，将喷气阀门打开，放气完后，打开电压力锅的盖子自然冷却至室温。用蒸馏水冲洗3次，PBS液洗3×3 min，加入1∶100稀释的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS液洗3×3 min，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS液洗3×3 min，加入DAB显色，苏木素复染，脱水，树胶封片，观察。

1.2.4微波抗原修复法将组织切片脱蜡入水后，抗原修复液0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH值6.0)100～150 mL倒入微波盒中，将组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入微波盒中，盖紧盖子，放入微波炉内，先高火处理5 min，中火继续处理10 min，使容器内液体温度保持在98 ℃左右。停火取出容器，冷却至室温。余下步骤与1.2.3相同。

1.2.5煮沸抗原修复法将组织切片脱蜡入水后，抗原修复液0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入煮锅中，将组织切片置于耐高温塑料切片架上，轻轻放入煮锅内，组织切片必须位于液面下，沸腾后计时30 min,熄火，冷却至室温。余下步骤与1.2.3相同。

1.2.6免疫组织化学染色检测步骤参照试剂盒操作说明。PBS代替一抗体作为阴性对照。每一抗体均采用相同浓度进行实验。采用双盲法由2位主治以上病理医生进行评分，阳性表达判断标准：抗原抗体结合物在细胞膜/细胞质/细胞核出现均匀棕色细颗粒。免疫组织化学染色呈深棕色者定位强阳性(+++)，阳性细胞数占50%～80%；浅棕黄色定为弱阳性(+)，阳性细胞数占10%～<20%；介于二者之间的定为阳性(++)，阳性细胞数占20%～<50%；每张切片观察10个高倍视野，数100个肿瘤细胞。结果以“染色强度/阳性细胞数比例”表示。

2结果

选取本病理科室最常用10种抗体分别进行3种抗原修复法免疫组织化学标记，其中9种抗体试剂盒操作说明推荐方法都是相同的热修复方法，1种抗体试剂盒操作说明推荐方法是不需要热修复，而热修复包括高温高压抗原修复法、微波抗原修复法、煮沸抗原修复法3种方法。采用热修复方法不同，实验结果也不同。作者通过临床研究发现，有3种抗体(如CD34、HER_2、CEA)分别采用3种抗原修复方法预处理后，染色结果一致，均为阳性；另外4种抗体(如LCA、CD45RO、CD79a、CK)，分别采用3种抗原修复方法预处理后，染色结果不一致，高温高压抗原修复法比其他两种抗原修复法染色结果强；抗原表达在细胞核的3种抗体(如ER、PR、P53)，分别采用3种抗原修复方法预处理后，染色结果不一致，高温高压抗原修复法比其他两种抗原修复法染色结果更强，有3种抗体采用3种抗原修复法处理结果一致，而高温高压抗原修复法比其他两种抗原修复法提高阳性表达的有7种，而且核内表达者更加明显。10种抗体3种抗原修复法免疫组化标记阳性的表达结果，见表1。

3讨论

免疫组织化学染色过程中抗原修复是一个重要环节，不恰当的抗原修复可以导致假阳性或假阴性的结果。病理标本大部分都采用10%中性福尔马林液固定，组织固定过程中，组织中的蛋白质分子交联增加，抗原决定簇被封闭，在很大程度上影响免疫组织化学反应结果充分表达[5]。要提高免疫组织化学反应阳性表达率及制片质量，就必须有一种较好的抗原修复方法。

加热抗原修复(heat-induced-antigen retrieval,AR)技术是免疫组织化学发展史上重要里程碑[6]，3种抗原修复的原理大致相同，通过高频电磁波或高温高压作用，将组织中因用交联性固定剂甲醛处理而形成的醛链打开，使抗原充分暴露，达到修复的目的[7-8]。本实验通过对比3种不同抗原修复方法预处理进行比较，发现使用高温高压抗原修复方法预处理，明显优于微波修复。因为高温高压能克服微波炉使用中出现的批次差异和“冷热斑”的现象[9]，认为高温高压比其他加热方法更均一。电压力锅在15 Psi全压时，温度可达120 ℃ 左右。这样温度对一些核抗原的去遮蔽作用显示出明显优越。使更多的抗原得以暴露，使一些假阴性，弱阳性的标本得到阳性表达，组织阳性定位清晰，背景着色浅，非特异性着色弱，可以提高抗原抗体阳性检测率，操作简单，消耗时间短，阳性表达率较微波抗原修复法强；而微波法抗原修复时，因微波炉加热范围狭小，使组织切片接受微波的辐射不均匀而且量小，导致不同区域组织切片的处理强度也不一致，有明显的边缘效应，从而出现不同区域染色深浅不一的显色现象。同时微波炉热修复容易发生缓冲液干凅导致干片的现象，以及修复时间较长，组织易脱片[10]等多种弊端；而煮沸抗原修复时，抗原修复时间长，温度不易控制，也易使切片受热不均可导致组织的抗原活性恢复较差，从而影响免疫组化反应结果。高温高压抗原修复法明显优于微波抗原修复法与煮沸抗原修复法[11]。

从目前关于免疫组织化学反应的抗原技术的研究中发现，高温高压抗原修复灵敏度高，特异性强，结果稳定，重复性好，一次可以修复大量组织切片，而且修复液可以反复使用。节约时间，提高工作效率[12]，本研究也证明了这一点。本文列举了常用的10种抗体，是否符合免疫组织化学检测的所有抗体，还有待今后的继续研究证明，总之，高温高压抗原修复法是一种可提高免疫组织化学反应的较理想的预处理方法，值得推广应用。

参考文献

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[7]印永祥，张岩，赵华．不同抗原修复法对MRP2蛋白在正常足月胎盘中定位表达的影响[J]．临床与实验病理学杂志，2010，26(5)：632-633．

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[11]张富军，任娟，王飞苗，等．核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择[J]．西安交通大学学报:医学版，2010，31(2)：252-254．

[12]周道银，张乐之，龚燕芳．胸腹心包腔积液细胞诊断学图谱[M]．北京：人民军医出版社，1997：132．

(重庆市肿瘤研究所：1.病理科；2.检验科，重庆 400030)

作者简介：宋容 (1964-)，副主任技师，大学专科，主要从事病理切片质量管理工作。△通讯作者，Tel:13677608556；E-mail:2602214857@qq.com。

doi:·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.038

[中图分类号]R446.8

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)04-0540-03

(收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-10-21)