果王素对小鼠肺腺癌GP方案化疗肝脏损害的防治作用*

贺兼斌，张贻秋，向　志，唐建新，邓　湘，张　平

(1.湖南医药学院附属怀化市第一人民医院呼吸内科　418000;2.南华大学附属第一医院呼吸内科，湖南衡阳 421001)



果王素对小鼠肺腺癌GP方案化疗肝脏损害的防治作用*

贺兼斌1，张贻秋1，向志1，唐建新1，邓湘2，张平2

(1.湖南医药学院附属怀化市第一人民医院呼吸内科418000;2.南华大学附属第一医院呼吸内科，湖南衡阳 421001)

[摘要]目的本研究旨在观察果王素对肺腺癌小鼠使用GP方案化疗过程中对肝脏的保护作用，并初步探讨果王素护肝作用的相关机制。方法32只接种Lewis肺腺癌的C57BL/6J小鼠按随机数字表法随机分成4组：对照组、化疗组、低剂量果王素联合化疗组及高剂量果王素联合化疗组。给予相应药物干预，于接种后24 d处死各组小鼠，经眼球静脉丛取各组小鼠血液样本2 mL，全自动生化分析仪检测肝功能相关指标，酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度，测定肝匀浆中氧化及抗氧化酶活性，逆转录PCR(RT-PCR)检测肝脏TNF-α mRNA表达。结果化疗组有明显肝功能损害，予以果王素干预后，肝功能损害减轻；化疗组氧化应激指标升高，抗氧化酶活性降低，果王素干预后，氧化应激指标降低，抗氧化酶活性升高；化疗组血清中炎症因子TNF-α的浓度升高，肝脏中TNF-α表达增强，果王素干预后,TNF-α的表达降低。结论果王素能明显减轻化疗中肝功能损害的程度，起到护肝作用，其可能机制与清除氧自由基，抑制氧化应激及下调TNF-α表达抑制炎性反应有关。

[关键词]癌,非小细胞肺；α亚麻酸；药物疗法；氧化应激；肝损伤；炎症反应；果王素

肺癌是我国人群肿瘤的第1位死因，其中75%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。对于不能手术根治的中晚期患者，综合治疗中化疗是重要的治疗手段。目前常用抗肿瘤药多为化学合成的细胞毒类药物，对正常细胞和癌细胞选择性差，治疗中带来的毒副作用严重影响患者的生命质量，有的甚至不能耐受化疗而中断治疗。其中，肝脏损害是化疗中常见的毒副反应，防治化疗过程中的毒副反应，提高患者对化疗药物的耐受性是一项重要课题。虽然目前有较多减少毒副作用的西药用于临床，但大多价格昂贵，有时作用欠佳，中成药在脏器功能保护方面有独到的优势。本实验通过小鼠肺腺癌模型，行GP方案化疗，研究果王素(即猕猴桃果仁油脂肪酸)对小鼠肺腺癌GP方案化疗肝脏损害的防治作用。

1材料与方法

1.1材料C57BL/6J小鼠32只，雄性，体质量(20±2)g，购自中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，许可证号：SCXK11-00-0005，由南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。Lewis肺腺癌(鼠源)由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供；顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司(生产批号:040605)；健择(注射用盐酸吉西他滨)规格0.2 g/瓶，批号：A570546A，法国礼来有限公司(LILLY FRANCE)生产；果王素(浓度60%)由湖南湘西老爹生物有限公司惠赠；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione-SH peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(批号：20090311)；丙氨酸氨基转移酶(alanine amino tranferase，ALT)测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：200509；天门冬氨基酸氨基转移酶(aspartate amino transferase，AST)测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：200509；小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒为美国Bio Sources公司产品；MMLV第1链cDNA合成试剂盒，即用PCR扩增试剂盒，购于上海生工生物工程技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立按文献[1]方法建立动物肿瘤模型。

1.2.2分组及用药32只小鼠皮下移植处均成瘤，接种后第4天开始药物干预，小鼠分为4组：对照组、化疗组、低剂量果王素联合化疗组及高剂量果王素联合化疗组，每组8只。药物干预如下，(1)对照组：生理盐水每只小鼠0.4 mL/次，于5、12、19 d腹腔注射1次，蒸馏水0.3 mL/次，每日灌胃1次；(2)化疗组：接种4 d后开始腹腔注射药物，按GP方案，顺铂于接种后第5、12、19天各腹腔注射1次，剂量为3 mg/kg，体积为0.2 mL/次，吉西他滨于接种后第5、12、19天各腹腔注射1次，剂量每次为50 mg/kg，体积为0.2 mL/次；(3)低剂量果王素联合化疗组：化疗方案同化疗组，于接种后每天灌胃1次，剂量每次为果王素60 mg/kg，体积为0.3 mL/次；(4)高剂量果王素联合化疗组：化疗方案同化疗组，于接种后每天灌胃1次，剂量每次为果王素180 mg/kg，体积为0.3 mL/次。肿瘤接种24 d处死全部小鼠。

1.2.3观察指标及方法

1.2.3.1肝功能的测定用雅培C8000全自动生化分析仪检测ALT、 AST、胆红素(total bilirubin，TBIL)。

1.2.3.2肝组织匀浆中氧化酶及抗氧化酶活性的测定制备10% 的肝组织匀浆，GSH-Px、SOD、LPO、MDA的测定按照南京建成公司的试剂盒说明书进行。

1.2.3.3血浆中TNF-α的测定将血清按1∶2稀释，作为捕获抗体，加入用兔抗小鼠TNF-α单克隆抗体(IgG)包被的微孔板中，37 ℃孵育2 h，洗板后，加入与HPR连接的兔抗小鼠TNF-α单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，加入过氧化氢和四甲基联苯胺，ELISA测定450 nm吸光度值，与标准曲线对比，计算TNF-α浓度(ng/mL)。

1.2.3.4逆转录PCR(RT-PCR)半定量检测TNF-αmRNA表达从GenBank查取TNF-α mRNA基因序列，以Primer5软件设计引物,TNF-α：上游5′-CCA AAG GGA TGA GAA GTT CC-3′,下游5′- CTC CAC TTG GTG GTT TGC TA-3′ 扩增产物片段133 bp；内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：上游5′- GCA AGT TCA ACG GCA CAG-3′,下游5′-CGC CAG TAG ACT CCA CG AC -3′，片段大小141 bp，上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。采用TRIzo1法提取肝组织总RNA，按两步法RT-PCR试剂盒操作说明逆转录cDNA，并进行PCR扩增。PCR的反应时序为：(1)94 ℃预变性2 min；(2)96 ℃，15 s；(3)62 ℃，20 s；(4)70 ℃，60 s；共35个循环后72 ℃延伸5 min延伸，PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增条带结果，以Mkerker(上海鼎国生物公司)作为标准相对分子质量参照进行产物鉴定。用Totallab分析软件进行条带扫描分析，测量电泳条带密度，计算mRNA相对量。mRNA相对量=目标基因扫描值/GAPDH扫描值×100。

2结果

2.1各组小鼠肝功能的测定结果化疗对小鼠肝功能造成一定损害，与对照组比较，化疗组肝功能指标包括ALT、AST 和TBIL皆明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；高、低剂量预果王素联合化疗组与化疗组相比,ALT、AST、TBIL降低(P<0.01)，见表1。

2.2肝组织匀浆中氧化及抗氧化酶的测定结果化疗使小鼠肝组织内MDA和LPO水平急剧上升，氧化活性增加，肝功能损害加重，予以果王素干预，MDA和LPO水平呈下降趋势，低、高剂量果王素联合化疗组MDA和LPO水平与化疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)，化疗亦使小鼠肝组织SOD和GSH-Px活性明显减低，果王素能提高SOD和GSH-Px的活性，低、高剂量果王素联合化疗组SOD和GSH-Px水平与化疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)，具体情况见表2。

2.3各组小鼠血浆TNF-α水平及肝TNF-αmRNA表达化疗组血清中TNF-α水平明显升高，其肝组织中TNF-αmRNA表达亦明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，予以果王素处理后血清中TNF-α水平和肝组织中TNF-α mRNA表达明显下降，与果王素有剂量相关性，具体情况见表3、图1。

表1　各组小鼠肝功能的测定结果±s)

a:P<0.01,与对照组比较，b:P<0.01,与化疗组比较。

表2　肝组织匀浆中氧化酶及抗氧化酶活性的测定结果±s)

a:P<0.01,与对照组比较，b:P<0.01,与化疗组比较。

表3　各组小鼠血浆TNF-α水平及肝TNF-α mRNA

a:P<0.01,与对照组比较，b:P<0.01,与化疗组比较。

M：maker。1：对照组；2:高剂量果王素联合化疗组；3:低剂量果王素联合化疗组；4：化疗组。

图1肝TNF-α mRNA表达

3讨论

化疗是恶性肿瘤综合治疗的重要手段，目前常用抗肿瘤药多为化学合成的细胞毒类药物，对正常细胞和癌细胞选择性较差，治疗过程中可能带来严重的毒副作用影响患者的生命质量[2]。因化疗药物大多经肝脏代谢，药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是化疗常见的毒副反应，顺铂和吉西他滨是肺癌化疗的常用药物，两药联用为GP方案是NSCLC化疗的一线方案，两药皆有一定的肝功能损害，联用肝损害的风险增加[3]，甚至有些患者因难以耐受其不良反应而中断治疗，限制了GP方案的应用，因此在化疗过程中的护肝治疗成为一项重要课题。中国医学在护肝治疗中具有一定优势，本研究初步探讨果王素在GP方案化疗中的护肝作用及其机制。

果王素为猕猴桃果仁经临界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分为α-亚麻酸，其还含有一定量的维生素E及微量元素硒等[4]。研究表明果王素及其主要成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等作用[5-6]。其对化疗药物肝损害的保护作用鲜见报道。本研究中，化疗组小鼠肝功能指标较对照组明显升高，说明GP方案在抗肿瘤的同时，亦具有一定的肝功能损害。给予果王素干预后，肝功能指标明显下降，且其下降程度与果王素的剂量呈相关性，说明果王素对化疗引起的肝功能损害具有保护作用，高剂量的果王素护肝作用更明显。目前对肝功能损害的机制研究中，氧化应激机制已被广泛认可[7]，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一种普遍存在的活性氧分子，正常情况下与机体的抗氧化维持平衡，病理状态下，如ROS数量升高或抗氧化失常，就会导致体内微环境处于氧化应激状态，其中MDA是氧自由基使细胞膜中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化的终产物，对细胞毒性作用很大，其含量能直接反映脂质过氧化的速率和强度，并与自由基的浓度成正相关。SOD通过促进歧化超氧化物转变成过氧化氢而处理氧自由基，发挥抗氧化的作用。MDA水平的升高和SOD活性的降低是机体发生氧化应激的重要标志，SOD和MDA是评价氧化应激的重要指标。LPO为脂质过氧化物浓度，GSH-Px催化氧化谷胱甘肽转变成二硫化谷胱甘肽和过氧化氢，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进过氧化氢的分解，从而防止过氧化氢引起的细胞损伤，LPO和GSH-Px在氧化应激的动态平衡中亦起重要作用。在本研究中，化疗组肝脏中氧化指标MDA、LPO明显升高，而抗氧化指标SOD、GSH-Px明显下降，说明氧化应激在化疗肝功能损害中亦为重要的机制，氧化应激导致了肝功能损害。予以果王素干预后，肝功能各项指标明显好转，抗氧化酶升高，氧化应激指标下降，且与果王素的剂量呈相关性，说明果王素可以通过抑制氧化应激反应在化疗中起到保护肝脏的作用，大剂量的果王素抗氧化作用更为明显。细胞因子是一类调节机体免疫和神经内分泌功能的生物活性物质，它们与靶细胞表面的受体结合后，通过激活细胞内信号传导通路而诱导产生多种生物学效应。TNF-α是一种炎性反应细胞因子，有证据表明TNF-α参与了多种脏器损害的病理过程[8]，其可能机制为：TNF-α引起炎症细胞的聚集、浸润，进而释放更多的炎性介质，加重炎症的级放大，增加炎症损伤，进一步加重对组织的损害。本研究中亦发现，在化疗组小鼠血清中，TNF-α的浓度明显升高，其肝组织中TNF-α基因表达亦明显升高，说明TNF-α在化疗肝损害中起重要作用，予以果王素干预后，能明显降低血清TNF-α的浓度和抑制肝组织TNF-α的表达，降低肝功能损害，说明果王素能下调TNF-α的表达起到护肝作用。亦有研究表明，使用TNF-α抑制剂后，TNF-α表达下调，而脏器功能损害减轻，进一步说明TNF-α在脏器功能损害中的作用[9]。有研究表明氧化应激可与炎性反应相互影响，参与脏器损伤过程，其共同的枢纽可能在于核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，局部产生的氧自由基可激活NF-κB转位入核，诱导相关炎症基因的表达，而炎性损伤的细胞可进一步产生大量活性氧分子，加重脂质过氧化反应和氧化应激损伤[10]。果王素在GP方案化疗过程中的护肝作用机理可能与减轻氧化应激及抑制炎性反应皆有一定关系。

综上所述，果王素能明显减轻化疗中肝功能损害的程度，起到护肝作用，其可能机制为清除氧自由基，抑制氧化应激及下调TNF-α表达抑制炎性反应，果王素在抑

制肝脏损害的病理过程中更为具体机制尚不明确，有待进一步研究，但果王素在作为化疗中护肝的药物，无疑具有潜在的前景。

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Effect of kiwi essence for prevention and treatment of liver injury caused by GP chemotherapy in mice with lung adenocarcinoma*

HeJianbin1，ZhangYiqiu1，XiangZhi1，TangJianxin1，DengXiang2，ZhangPing2

(1.DepartmentofRespiration，theFirstPeople′sHospitalofHuaihua,HunanUniversityofMedicine,Huaihua,Hunan418000,China;2.DepartmentofRespiration，theFirstAfiliatedHospitalofNanhuaUniversity，Hengyang，Hunan421001，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the liver protective effect of kiwi essence in the mice with lung adenocarcinoma during using GP chemotherapeutic regimen,and to explore its related mechanism.MethodsThirty-two C57BL/6J mice bearing Lexis lung adenocarcinoma were randomly divided into 4 groups: control group,chemotherapy group,low dose kiwi essence combined chemotherapy group and high dose kiwi essence combined chemotherapy group.The mice in each group were given the corresponding medication intervention and sacrificed on 24 d after inoculation for taking 2 mL of blood sample by eye venous lexus.The automatic biochemical analyzer was used to detect the live function related indicators,the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the tumor necrosis factor-α(TNF-α) level,the oxidase and antioxidase activities in liver homogenates were measured and the liver TNF-α mRNA expression was detected by using RT-PCR.ResultsThe chemotherapy group had significant liver damage,which was alleviated after giving the kiwi essence intervention;the oxidation stress indicators in the chemotherapy group were elevated and the antioxidase activity was decreased,after kiwi essence intervention,the oxidation stress indicators were decreased,while antioxidase activity was increased;the serum inflammation factor TNF-α concentration in the chemotherapy group was elevated,the TNF-α expression in liver was enhanced,after kiwi essence intervention,the TNF-α expression was decreased.ConclusionKiwi essence could significantly reduce the degree of liver damage in chemotherapy and plays the liver-protecting effect.Its possible mechanism might be associated with scavenging the oxygen free radicals,inhibiting oxidative stress,down-regulating TNF-α expression and inhibiting the inflammatory reactions.

[Key words]carcinoma,non-small-cell lung；alpha-linolenic acid；drug therapy；oxidative stress；liver injury；inflammation；kiwi essence

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.007

基金项目：湖南省教育厅科研基金资助项目(2013C735)；湖南省中医药管理局科研基金资助项目(201281)。

作者简介：贺兼斌(1971-)，副主任医师，硕士研究生，主要从事呼吸内科基础与临床研究。

[中图分类号]R734.2：R284.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)06-0740-03

(收稿日期：2015-07-20修回日期：2015-10-16)