126份番茄材料的抗性基因分子标记检测

陈宝玲　甘桂云　王先裕　于琴芝　龙安四*（广西大学农学院，广西南宁 50004；广西农业科学院蔬菜研究所，广西南宁50007；桂林市经济作物技术推广站，广西桂林5400）



126份番茄材料的抗性基因分子标记检测

陈宝玲1甘桂云2王先裕1于琴芝3龙安四1*
（1广西大学农学院，广西南宁 530004；2广西农业科学院蔬菜研究所，广西南宁530007；3桂林市经济作物技术推广站，广西桂林541001）

摘 要：利用分子标记技术，对56份大、中果型番茄进行烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、叶霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根结线虫病抗性基因Mi-1 8个抗性基因的检测，对70份小果型番茄进行Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 5个抗性基因的检测。共获得含烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的材料71份；在番茄黄化曲叶病毒病的3个抗性基因方面，含纯合抗性基因Ty-1的材料7份，杂合16份；含杂合抗性基因Ty-2的材料1份；含纯合抗性基因Ty-3的材料5份，杂合7份。真菌性病害方面，含叶霉病抗性基因Cf-9的材料101份；含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，杂合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根结线虫病抗性基因Mi-1的材料45份。供试番茄材料中，DHG-27同时含有7个抗性基因；含有6个抗性基因的材料有5份，分别为：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5个抗性基因的有HG-3、XHG-35 2份材料。

关键词：番茄；分子标记；抗性基因检测

陈宝玲，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：chenbl1990721@163.com

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，因其美味多汁、营养丰富，一直深受人们的喜爱，但是由于连年种植造成严重的连作障碍，番茄病害已达40多种（杜永臣 等，1999）。广西地区发生较为严重的有晚疫病、叶霉病、枯萎病、烟草花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病、番茄根结线虫病等。选用番茄抗病品种是解决病害问题的根本途径之一（孔凡慧 等，2015）。赵杨等（2012）指出，目前我国针对番茄主要病害尚缺乏免疫和高抗品种，可能的原因是育成的番茄品种缺乏相关抗病基因。抗病性鉴定是抗病育种的首要工作，常规鉴定方法费时费力，易受环境及人为主观因素影响，且难以对多个抗性同时进行鉴定，随着分子标记技术的迅速发展，可以在苗期进行大量的抗病性鉴定，不受时间地域限制，显著加速育种进程（吴媛媛 等，2009）。本试验利用分子标记技术，对126份番茄材料进行抗性基因检测，以便追踪目标基因，在育种中实现分子标记辅助选择，为今后番茄聚合抗病育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为广西大学农学院番茄课题组从国内外收集的126份番茄材料，经多代分离自交纯化的高代自交系（表1），每一代都严格筛选单株留种，于2015年3月种植在广西武鸣试验基地。其中56份大、中果型番茄进行烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、叶霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根结线虫病抗性基因Mi-1共6种病害8个抗性基因的PCR检测；70份小果型番茄检测Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 共5种病害的5个抗性基因。

1.2 DNA的提取及试验试剂

DNA提取采用改良的CTAB法（陈昆松 等，2004），取新鲜嫩叶作为样品提取番茄基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测纯度，将提取的DNA用TE稀释至400 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。试验使用的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、CTAB等分子试剂均购自Transgene公司。试验引物序列（表2）由深圳华大基因科技服务有限公司合成。

表1 126份番茄材料的类型及来源

1.3 抗性基因检测及PCR反应体系

叶霉病抗性基因Cf-9、烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、根结线虫病抗性基因Mi-1的检测参照孙亚林（2008）开发的标记（表2）。PCR反应体系25 μL：2.5 μL 10× Buffer with Mg2+，0.5 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各0.5 μL（100 μmol·L-1），0.5 μL DNA 模板（100 ng·μL-1），0.5 U Taq DNA聚合酶，ddH2O 补足25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，适宜Tm值退火1 min，72 ℃延伸80 s，32个循环；72 ℃延伸8 min，扩增产物4 ℃保存。

参照Matthew等（2010）、Merk和Foolad （2012）利用标记位点dTG328设计的CAPS引物检测番茄抗晚疫病Ph-3基因（表2）。PCR反应体系20 μL：2 μL 10×Buffer with Mg2+，0.4 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各0.4 μL（100 μmol·L-1），1 μL DNA 模板（200 ng·μL-1），0.3 U Taq DNA聚合酶，ddH2O补足20 μL。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。酶切反应体系25 μL：2.5 μL BstNI Buffer，0.3 μL BstN I内切酶，2.2 μL ddH2O，20 μL PCR反应产物，37 ℃酶切2 h。

表2 用于分子标记的引物信息

枯萎病抗性基因I-2的检测参照徐薪惟（2012）开发的SNP标记（表2），PCR反应体系25 μL：2.0 μL 10× Buffer with Mg2+，2.5 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），0.5 μL DNA 模板（100 ng·μL-1），0.5 U Taq DNA聚合酶，ddH2O补足25 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃ 7 min，扩增产物4 ℃保存。

番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1的检测参照华中农业大学番茄课题组葛乃蓬等（2014）开发的双重SNP标记（表2），PCR反应体系20 μL：2.0 μL 10× Buffer with Mg2+，0.4 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物（100 μmol·L-1）各0.4 μL，正反向引物（100 μmol·L-1）各0.2 μL，1.0 μL DNA 模板（200 ng·μL-1），0.2 U Taq DNA聚合酶，ddH2O 补足20 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1min，35个循环；72 ℃10 min，扩增产物4 ℃保存。

番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3的检测参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的引物进行（未列出）。PCR反应体系10 μL：2×Go Taq GreenMaster Mix 5 μL，正反向引物（100 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板（200 ng·μL-1）0.5 μL，ddH2O 补足至10 μL。反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 8 min，扩增产物16 ℃保存。

上述PCR及酶切产物在含有核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中电泳40 min，120 V恒定电压，最终结果在ChemiDoc MP型凝胶成像系统上显示。

2 结果与分析

2.1 烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的检测

图1为部分材料Tm-2a的PCR扩增结果。含Tm-2a基因的材料可以扩增出472 bp的特异性片段，不含该抗性基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，71份含有抗性基因Tm-2a，55份不含抗性基因。

图1 烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a检测结果M：Marker；CK1：阳性对照；CK2：阴性对照；1～22：不同番茄材料，下图同。

2.2 番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的检测

经Ty-1引物双重SNP扩增（图2），含纯合抗性基因的材料扩增出938 bp的特异性片段，含杂合抗性基因的材料扩增出948 bp和1 343 bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出1 343 bp的片段。经检测，126份材料中，含纯合抗性基因Ty-1的有7份，杂合的16份，103份材料不含Ty-1基因。

经Ty-2引物扩增（图3），含抗性基因的材料扩增出300 bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出600 bp的片段。经检测，56份大、中果型材料中，均不含纯合抗性基因Ty-2，仅DHG-34含有杂合抗性基因。经Ty-3引物扩增（图4），含纯合抗性基因的材料扩增出500 bp的特异性片段，含杂合抗性基因的材料扩增出500 bp和300 bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出300 bp的片段。经检测，56份大、中果型材料中，含Ty-3纯合抗性基因的有5份，杂合的7份，无抗性基因的材料44份。

2.3 叶霉病抗性基因Cf-9的检测

经Cf-9引物扩增（图5），含抗性基因的材料扩增出415 bp的特异性片段，不含抗性基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，有101份含有抗性基因Cf-9，25份不含抗性基因。

2.4 晚疫病抗性基因Ph-3的检测

经Ph-3引物扩增（图6），所有材料均可扩增出400 bp的特异性片段，经BstN I酶切后，含纯合抗病基因的材料扩增出250 bp和150 bp的特异性片段，含杂合抗病基因的材料扩增出150、250 bp 和400 bp的特异性片段，不含抗病基因的材料不存在酶切位点，呈现400 bp的片段。经检测，56份大、中果型番茄材料中，含纯合抗性基因Ph-3的材料有1份，材料编号为DHG-11；含杂合抗性基因Ph-3的有6份，其余不含抗性基因。

2.5 枯萎病抗性基因I-2的检测

经I-2引物扩增（图7），含抗病基因的材料扩增出1 300 bp的特异性片段，不含抗病基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，68份含有抗性基因I-2，58份不含抗性基因。

图2 番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果

图3 番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果

图4 番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测结果

图5 叶霉病抗性基因Cf-9检测结果

2.6 根结线虫病抗性基因Mi-1检测

图6 晚疫病抗性基因Ph-3检测结果

图7 枯萎病抗性基因I-2检测结果

图8 根结线虫病抗性基因Mi-1检测结果

表3 大、中果型番茄材料抗性基因检测结果

经Mi-1引物扩增（图8），含抗性基因的材料扩增出1 353 bp和556 bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出1 287 bp的特异性片段。经检测，全部供试材料中，45份材料含有抗性基因Mi-1，81份不含抗性基因。

以上的试验结果表明（表3、4），126份供试材料中，含烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的材料有71份。在番茄黄化曲叶病毒病的3个抗性基因方面，含纯合抗性基因Ty-1的材料7份，杂合16份；仅1份材料含杂合抗性基因Ty-2；含纯合抗性基因Ty-3的材料5份，杂合7份。在真菌性病害方面，含叶霉病抗性基因Cf-9的材料最多，有101份；含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，杂合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根结线虫病抗性基因Mi-1的材料共45份。供试番茄材料中，DHG-27同时含有7个抗性基因；含有6个抗性基因的材料有5份，分别为：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5个抗性基因的有HG-3、XHG-35 2份材料。

表4 小果型番茄材料抗性基因检测结果

3 结论与讨论

本试验从126份不同类型的番茄材料中筛选出多份兼抗多种病害的材料。其中含有抗性基因Tm-2a、Cf-9、I-2、Mi-1的材料较多，为今后培育多抗聚合番茄材料提供更多选择。

多份材料番茄黄化曲叶病毒病Ty-1和Ty-3抗性基因的检测结果一致，这可能与Ty-1和Ty-3基因都位于6号染色体有关。付蓉蓉等（2011）认为，同时含有纯合抗性基因Ty-1和Ty-3的番茄材料具有更高更稳定的抗性。曹永翔和张喜春（2007）指出，Cf-9抗性基因对中国目前的2个叶霉病优势生理小种具有较强抗性。含有Cf-9抗性基因的供试材料最多，对防御叶霉病有巨大优势。虽然国内外学者在番茄晚疫病抗病性鉴定方面取得了一定成果，但目前生产中还没有真正被应用的抗病品种（赵杨 等，2012）。根据本试验结果，含有晚疫病纯合抗性基因的材料只有DHG-11，后期试验应充分合理利用此材料。吴媛媛等（2010）报道，I-2基因可同时抗枯萎病生理小种1和生理小种2，在番茄抗枯萎病育种中应重视含有该基因的材料。曹永翔和张喜春（2007）还指出，Mi-1基因可抗南方根结线虫、花生根结线虫、爪洼根结线虫3种主要线虫，含有Mi-1基因的材料对番茄连作严重、根结线虫病高发地区具有重要意义。

分子标记技术以抗病基因研究为基础，具有操作简便、用时短的优点，可进行高通量的抗病筛选，这对缩短抗病育种年限及减少工作量具有重要意义。培育兼抗多种病害的番茄品种是防治番茄病害最经济有效的方法。本试验对126份番茄材料进行抗性基因的分子标记辅助选择，发现多数材料具有多种抗性基因。下一步试验应进行更多材料的相关抗性基因检测，尽可能检测更多的抗性基因，同时对部分杂合抗病基因材料进一步筛选纯化。

孙亚林（2008）指出，在育种过程中运用分子标记辅助选择对基因型进行选择时，所用标记大多与目标基因具有一定的遗传距离，分子标记会与目标基因发生连锁互换，从而在检测过程中出现假阳性，影响最后的选择效果。因此为了验证分子标记技术的准确性，在后期的试验中，应对材料进行室内及田间接种鉴定，进一步确定材料对病害的抗感程度，并且对农艺性状进行观测统计，从而筛选出抗多种病害且农艺性状优良的番茄材料，同时应继续收集番茄种质资源，为今后培育品质优良、兼抗多种病害的番茄品种奠定基础。

参考文献

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陈昆松，李方，徐昌杰，张上隆，傅承新.2004.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取.遗传，26（4）：529-531.

杜永臣，严准，王孝宣，李树德，朱德蔚.1999.番茄育种研究主要进展.园艺学报，26（3）：161-169.

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葛乃蓬，崔龙，李汉霞，叶志彪.2014.番茄抗黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的双重SNP标记的开发.园艺学报，28（1）：195-200.

孔凡慧，李冬艳，许向阳，姜景斌，李景富.2015.多抗、耐贮存番茄育种材料的创制.中国蔬菜，（9）：20-25.

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吴媛媛，李海涛，张子君，邹庆道，吕文书，杨国栋.2009.番茄抗晚疫病基因Ph-3的RAPD及CAPS标记.沈阳农业大学学报，40（6）：716-719.

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Molecular Marker Detection of Resistant Genes from 126 Tomato Varieties

CHEN Bao-ling1，GAN Gui-yun2，WANG Xian-yu1，YU Qin-zhi3，LONG An-si1*
（1Agronomy College of Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China；2Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China；3Guilin City Cash Crops Technology Extention Station，Guilin 541001，Guangxi，China）

Abstract：Molecular marker technolocy was used to test 8 resistant genes from 56 tomato materials with large and middle fruit types including Tobacco mosaic virus disease resistant gene Tm-2a，Tomato yellow leaf curl virus disease resistant genes Ty-1、Ty-2、Ty-3，leaf mould resistant gene Cf-9，late blight resistant gene homozygous Ph-3，fusarium wilt resistant genes I-2，and root knot nematode resistant gene of Mi-1. Besides，5 resistant genes including Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 from 70 tomato materials of small fruit types were also tested. 71 materials with resistant gene Tm-2a，7 materials with pure resistant gene Ty-1，16 materials with heterozygosisbook=41,ebook=46resistant gene Ty-1，1 material with heterozygosis resistant gene Ty-2，5 materials with pure resistant gene Ty-3，7 materials with heterozygosis resistant gene Ty-3，101 materials with resistant gene Cf-9，1 material with pure resistant gene Ph-3，6 materials with heterozygosis resistant gene Ph-3，68 materials with resistant gene I-2，45 materials with resistant gene Mi-1.Among them，DHG-27 contains 7 resistant genes. There were 5 materials （DHG-11，DHG-20，DHG-34，ZHG-8，HG-4）containing 6 resistant genes. There were 2 materials（HG-3 and XHG-35）containing 5 resistant genes.

Key words：Tomato；Molecular marker；Resistant gene detection

*通讯作者（

Corresponding author）：龙安四，男，农艺师，专业方向：园艺方面的试验和栽培技术研究，E-mail：longansi2005@163.com

收稿日期：2015-11-06；接受日期：2016-04-19

基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻14121006-5-2、桂科合14123001-3、桂科攻13254002-2），国家大宗蔬菜产业技术体系桂林综合试验站项目（CARS-25-G-37），百色国家农业科技园区建设示范项目（桂科能 1598022-1-1）