系统性红斑狼疮合并冠状动脉性心脏病患者Th1/Th2失衡的研究

2016-06-14 08:40珊,俞娟,张
重庆医学 2016年2期
关键词:红斑狼疮系统性冠心病

赵 珊,俞 娟,张 虹

(云南省第一人民医院风湿免疫科,昆明 650032)

系统性红斑狼疮合并冠状动脉性心脏病患者Th1/Th2失衡的研究

赵珊,俞娟,张虹△

(云南省第一人民医院风湿免疫科,昆明 650032)

[摘要]目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)合并冠状动脉性心脏病(简称冠心病)患者的Th1/Th2是否存在失衡状况。方法收集SLE患者(SLE组)、SLE合并冠心病患者(合并组)及健康对照者(对照组)外周血,real-time PCR法检测外周血Th1/Th2细胞转录因子T-bet/GATA-3的表达;流式细胞术检测Th1/Th2细胞内IFN-γ及IL-4水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者外周血清中IFN-γ及IL-4水平并与对照组比较。结果SLE组患者外周血Th1细胞转录因子T-bet表达水平、CD4+ T细胞内IFN-γ分泌水平及血清IFN-γ水平均明显低于对照组(P<0.05)。合并组患者外周血Th1细胞转录因子T-bet表达水平、CD4+ T细胞内IFN-γ分泌水平及血清IFN-γ水平均明显高于SLE组患者及对照组(P<0.05);合并组患者外周血Th2细胞转录因子GATA-3表达水平、CD4+ T细胞胞内IL-4分泌水平及血清IL-4水平均明显低于SLE组患者及对照组(P<0.05)。结论SLE合并冠心病患者存在Th1优势活化的Th1/Th2失衡状态,这种失衡状态可能与疾病的发生发展有关。

[关键词]红斑狼疮,系统性;冠心病;T淋巴细胞,辅助诱导;Th1;Th2

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫疾病,可累及心肌、心包及冠状动脉,是冠状动脉性心脏病(简称冠心病)的独立危险因素,可加速冠心病的进程,是影响冠心病患者预后的重要因素之一[1-3]。Th1、Th2是辅助性CD4+T细胞重要的亚群,健康人Th1、Th2保持着一种平衡状态,Th1/Th2失衡与多种疾病相关,如感染[4]、肿瘤[5]、自身免疫疾病[6]等。近年来有研究表明Th1/Th2失衡参与冠心病的发生发展[7]。本文通过多种方法测定SLE合并冠心病患者体内Th1/Th2相关细胞因子,以期明确Th1/Th2平衡紊乱在SLE合并冠心病发病中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料选择2010年10月至2014年12月在本院住院的SLE合并冠心病患者40例(合并组),其中,男16例,女24例,平均年龄(52.32±7.86)岁;未合并冠心病的SLE患者40例(SLE组),其中,男14例,女26例,平均年龄(51.18±6.91)岁;健康对照者40例(对照组),其中,男16例,女24例,平均年龄(53.27±7.74)岁。所有SLE患者均符合美国风湿病学会推荐的诊断标准[8],所有SLE合并冠心病患者需满足以下条件:(1)心绞痛、心肌梗死典型的临床症状、心电图改变及心肌酶学的酶谱变化;(2)冠心病发作史;(3)冠状动脉造影或冠状动脉CT血管成像证实存在冠状动脉狭窄,并伴随心肌缺血症状。未合并冠心病的SLE患者排除以上冠心病症状或病史,健康对照者采用同期来医院体检的健康成人,排除肝、肾、心血管及神经系统疾病,各项体检指标正常。

1.2血样本采集及分离无菌采集抗凝静脉血15 mL及促凝血3 mL,促凝血室温放置30 min后离心收集血清并于-80 ℃冰箱冻存;抗凝血加等量磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后,缓慢叠加至淋巴细胞分离液Ficoll(Sigma公司)上,2 000 r/min离心20 min,收集中间白色细胞层。PBS液重复洗涤3次,离心收集单个核细胞,混悬于含1%双抗(Invitrogen公司)和10% FBS(Gibco公司)的RPMI-1640培养液(Invitrogen公司)中备用。

1.3real-time PCR检测Th1/Th2细胞转录因子取1×106单个核细胞溶解于1 mL Trizol(Invitrogen公司)中,采用酚-氯仿法抽提RNA,以Oligo-dT引物逆转录成cDNA。定量PCR采用SYBR Green PCR Mastermix试剂盒(ABI公司),参照参考说明书进行。其中,扩增Th1细胞转录因子T-bet mRNA的引物为,上游5′-CAA GCA GGG ACG GCG GAT GT-3′和下游5′-TTG GAC GCC CCC TTG TTG TTT G-3′;扩增Th2细胞转录因子GATA-3 mRNA的引物为,上游5′-GTG CCC GAG TAC AGC TCC GGA-3′和下游5′-GAG CCC ACA GGC ATT GCA GAC A-3′。所以,PCR反应在ABI 7300仪器上进行。转录因子mRNA的表达水平以T-bet或GATA-3与内参基因β-actin的比值表示。

1.4流式细胞法检测CD4+T细胞内IFN-γ及IL-4的分泌水平取1×106单个核细胞悬于1 mL细胞培养液中,加入PMA(终浓度0.1 mg/mL,Sigma公司)、Ionomycin(终浓度1 mg/mL,Sigma公司)及Golgistop(2 μL,BD公司),混匀后于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4~6 h。收集细胞,PBS液洗涤1遍,加抗CD3-Percp、抗CD4-APC各1 μL,常温孵育30 min;PBS液洗涤2遍后加破膜液(BD公司)常温孵育20 min;PBS液洗涤2遍后加抗IFN-γ-FITC、抗IL-4-PE各1 μL,常孵育40 min;洗涤2遍后加PBS液200 μL上流式细胞仪(BD公司)检测。

1.5ELISA法检测血清中IFN-γ及IL-4的水平人IFN-γ及IL-4 ELISA检测试剂盒购自eBioscience公司,操作均严格按照试剂盒说明书进行,每个样本做2个复孔。

2结果

2.1各组患者外周血Th1/Th2细胞转录因子比较real-time PCR检测Th1/Th2细胞转录因子的结果见图1,SLE组患者Th1细胞转录因子T-bet的表达水平明显低于对照组(P<0.05),Th2细胞转录因子GATA-3表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P=0.36);合并组患者T-bet表达水平明显高于SLE组患者及对照组(P<0.01),而GATA-3的表达水平明显低于SLE组患者及对照组(P<0.01)。

a:P<0.05,b:P<0.01。

图1real-time PCR检测各组患者Th1/Th2

细胞转录因子T-bet、GATA-3的表达

2.2各组患者外周血Th1/Th2细胞因子分泌能力比较流式细胞仪检测CD4+T细胞胞内IFN-γ及IL-4分泌水平,见图2~3。SLE组患者Th1细胞因子IFN-γ的分泌水平明显低于对照组(P<0.05),Th2细胞因子IL-4分泌水平与对照组比较差异无统计学意义(P=0.54);合并组患者IFN-γ分泌水平明显高于SLE组患者及对照组(P<0.05),而IL-4的分泌水平明显低于SLE组患者及对照组(P<0.01)。

a:P<0.05,b:P<0.01。

图3流式细胞仪检测各组患者CD4+T

细胞内IFN-γ及IL-4水平

2.3各组患者外周血IFN-γ及IL-4水平比较ELISA法检测外周血IFN-γ及IL-4水平,结果见表1。SLE组患者血清IFN-γ的水平明显低于对照组(P<0.01),IL-4的水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P=0.214);合并组患者血清IFN-γ的水平明显高于SLE组患者及对照组(P<0.01),而IL-4的水平明显低于SLE组患者及对照组(P<0.01)。

表1 ELISA法检测各组患者外周血IFN-γ

a:P<0.01,与对照组比较;b:P<0.01,SLE组比较。

3讨论

Th1、Th2细胞是辅助性CD4+T细胞(Th细胞)的两个重要亚群,Th1细胞分泌IFN-γ、IL-12、TNF-α等,辅助细胞免疫反应;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等,辅助体液免疫反应。SLE的发病与Th1/Th2失衡有密切关系,尽管没有统一的结论,大多学者认为SLE患者Th1/Th2失衡表现为Th1细胞受抑制而Th2细胞功能亢进的状态[9],进而过度激活B细胞,产生大量自身抗体造成免疫损伤。本研究中未合并冠心病的SLE患者与对照组比较,Th1细胞转录因子表达下调,且Th1细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力及血清中IFN-γ的水平均明显降低,说明SLE患者的Th1反应受到抑制,与文献结果[8]一致。

SLE常累及心血管系统,冠心病是SLE较常见的一种并发症。动脉粥样硬化及粥样斑块的形成和破裂是冠心病的病理基础[10]。近年来研究发现Th1细胞因子IFN-γ参与动脉粥样硬化的形成和发展[11]:IFN-γ一方面通过招募巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等炎症细胞,介导病变处血管的炎性反应;另一方面粥样斑块处的巨噬细胞及平滑肌细胞中均发现IFN-γ受体的大量表达,说明IFN-γ可直接作用于粥样斑块的形成细胞。本研究发现SLE合并冠心病患者的Th1细胞转录因子明显上调,而Th2细胞转录因子明显下调,且患者CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力及外周血IFN-γ水平均呈现上升状态,而Th2细胞转录因子及Th2细胞因子IL-4均被下调,说明SLE合并冠心病患者存在偏向Th1细胞反应的失衡,Th1细胞的增多及Th1细胞因子IFN-γ的过多分泌是SLE合并冠心病的重要发病机制之一。

本研究的一个有趣发现是未合并冠心病的SLE患者Th1细胞反应受抑制,而SLE合并冠心病患者的Th1反应亢进。这种看似矛盾的结果恰恰说明了SLE及其并发症在发病机制上的复杂性[12-14]。韩锋等[15]发现狼疮性肾炎患者外周血Th1细胞上调,且与疾病活动度呈正相关。这些研究说明尽管未合并冠心病的SLE呈现Th1抑制的失衡反应,但随着患者发生各种各样的并发症,其Th1/Th2平衡会随之发生变化,呈现出与未合并冠心病的SLE不同,而与并发症相一致的Th1/Th2失衡状态。这一方面解释了诸多SLE患者Th1/Th2失衡研究中的不一致现象,可能是选取的患者发生的并发症不一致导致的;另外也提示广大研究人员,SLE患者的Th1/Th2失衡现象是一个动态过程,处于疾病不同阶段或伴随着不同并发症的SLE患者,其免疫紊乱机制可能不同,需仔细分类后再作分析。

综上所述,本研究通过综合研究Th1/Th2细胞转录因子,Th1/Th2细胞分泌因子及血清细胞因子水平探讨未合并冠心病的SLE及SLE合并冠心病患者的Th1/Th2失衡状态,发现SLE合并冠心病患者呈现Th1反应亢进,Th2受抑制的现象,提示亢进的Th1反应可能是SLE患者并发冠心病的重要机制之一。

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Imbalance of Th1/Th2 in patients with systemic lupus erythematosus combined with coronary heart disease

ZhaoShan,YuJuan,ZhangHong△

(DepartmentofRheumatology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650032,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the imbalance of Th1/Th2 cell response in patients with systemic lupus erythematosus(SLE) combined with coronary heart disease.MethodsSLE patients,SLE patients with coronary heart disease and healthy controls were enrolled and blood samples were collected.T-bet/GATA-3,the transcription factors of Th1/Th2 cells,were detected by real-time PCR;the intracellular cytokines IFN-γ and IL-4 in CD4+ T cells were stained by fluorescent antibodies and detected by flow cytometry;the level of serum IFN-γ and IL-4 were detected by ELISA.ResultsComparing with healthy control group,the expression level of Th1 transcription factor T-bet,the introcellular secretion of IFN-γ in CD4+ T cells and the serum IFN-γ were all decreased in non-coronary heart disease patients with SLE(P<0.05).Comparing with non-coronary heart disease patients with SLE or healthy control group,the expression level of Th1 transcription factor T-bet,the introcellular secretion of IFN-γ in CD4+ T cells and the serum IFN-γ were all increased in patients with SLE combined coronary heart disease(P<0.05);while the expression level of Th2 transcription factor GATA-3,the introcellular secretion of IL-4 in CD4+ T cells and the serum IL-4 were all decreased in patients with SLE combined coronary heart disease(P<0.05).ConclusionThere were imbalance towards Th1 cell response in patients with SLE combined coronary heart disease,which may related to the occurrence and development of disease.

[Key words]erythematosus,systemic;coronary disease;T-lymphocytes,helper-inducer;Th1;Th2

作者简介:赵珊(1972-),副主任医师,硕士,主要从事结缔组织病合并肺间质纤维化、肺动脉高压、感染、冠心病的临床诊断与治疗研究。 △通讯作者,E-mail:0428zhanghong@sina.com。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.022

[中图分类号]R392

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)02-0216-03

(收稿日期:2015-08-24修回日期:2015-09-22)

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