宫颈癌患者外周血PD-1检测的临床价值

伍金华,甄　波,陈建勇,牛映红

(1.江门市中心医院 检验科，广东 江门529030；2.江门市中心医院 妇科，广东 江门529030)



*通讯作者

宫颈癌患者外周血PD-1检测的临床价值

伍金华1*,甄波2,陈建勇1,牛映红1

(1.江门市中心医院 检验科，广东 江门529030；2.江门市中心医院 妇科，广东 江门529030)

摘要：目的评价外周血PD-1检测对宫颈癌早期诊断的临床价值。方法采用流式细胞术检测72例宫颈癌患者，63例同期CINⅢ患者和60名体检健康妇女外周血PD-1含量。分析PD-1含量与宫颈癌临床病理参数的相关性。利用受试者工作特征曲线(ROC)分析外周血PD-1对宫颈癌的诊断价值。结果宫颈癌患者外周血PD-1含量((15.23±1.05)%)显著高于CINⅢ患者((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)及健康对照者((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01)。宫颈癌患者中，Ⅲ+Ⅳ期患者((16.85±1.74)%)高于Ⅰ+Ⅱ期((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01)；有淋巴结转移患者((16.56±1.37)%)高于无淋巴结转移患者((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)。宫颈癌患者外周血PD-1含量在不同分化程度及病理类型分组间无统计学差异。外周血PD-1诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)为0.925。当外周血PD-1取值为15.07%时，其诊断宫颈癌的敏感度和特异度分别为75.12%和88.47%。结论外周血PD-1可能是宫颈癌早期辅助诊断及预后判断有益的标志物。

关键词：宫颈肿瘤；PD-1；生物学标记；流式细胞术

(ChinJLabDiagn,2016,20:0779)

子宫颈癌(简称宫颈癌)是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌的发病率逐年升高[1]，早期诊断宫颈癌是治疗和延长患者生存期的关键。宫颈癌的确诊主要是依靠病理诊断，但是病理诊断是有创性检查，且病理的早期阳性诊断率较低，不利于宫颈癌的早期筛查诊断和治疗。因此，积极寻找一种简便易行、创伤小、灵敏度高的新型肿瘤标志物对于宫颈癌的早期辅助诊断和治疗具有非常重要的意义。

近年来的研究发现，程序性细胞死亡分子1(programmed death-1，PD-1) 作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员，在介导肿瘤细胞免疫逃逸中发挥着重要的作用，成为肿瘤检出和预后判断的新的生物学指标。PD-1 通过与其配体PD-L1 结合，抑制CD4 和CD8 T细胞的增殖和活化，负性调控机体免疫应答过程，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长[2]。本研究运用流式细胞术检测了宫颈癌患者、宫颈鳞状上皮内瘤样病变Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasiam，CINⅢ)患者和健康对照者外周血PD-1含量，分析PD-1的表达与宫颈癌临床病理特征的关系，旨在探讨其对宫颈癌早期诊断的临床价值。

1材料与方法

1.1标本来源

选择2013年9月至2014年9月广东省江门市中心医院妇科宫颈癌患者72例，按国际妇产科协会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2000 标准分期，年龄33-71岁，平均年龄49.2岁，中位年龄为51.5岁。选择同期CINⅢ患者63例，年龄28-56岁，平均48.8岁，中位年龄为50.7岁。诊断均经组织病理学证实，均无其他合并症。同期门诊体检健康妇女60名，年龄29-63岁，平均47.6岁，中位年龄为49.7岁。所有研究对象均为女性，均签署知情同意书。3组研究对象要求年龄分布接近，差异无统计学意义，P>0.05。

1.2仪器与试剂

流式细胞仪、溶血剂(美国Beckman Coulter EPICS XL)；荧光抗体:PE-Cy5标记人CD3单抗、 PE标记人PD-1单抗、PE标记人PD-L1单抗和PE标记人IgGI同型对照抗体(美国EB公司)。

1.3方法

1.3.1流式细胞术细胞样本的制备分别抽取3组研究对象EDTA-K2抗凝静脉血3 ml，即时送检制备CD3+PD-1+T细胞，具体加样步骤为：5 μl CD3抗体+5 μl PD-1抗体+50 μl全血；轻微混匀后室温避光保存30 min，加入250 μl溶血剂轻微混匀，室温避光保存12 min，加1 mL流式细胞仪鞘液1 500 r/min 离心5 min洗涤,共洗涤2次，加500 μl鞘液重悬细胞,3 h内上机检测。

1.3.2流式细胞样本的检测每次试验均设立空白对照和同型对照。以SSC-FS设门，计数10000个淋巴细胞，观察CD3+PD-1+T细胞的表达情况。计算CD3+PD-1+T细胞占淋巴细胞的比例,结果以阳性率(%)表示。

1.4统计学分析

2结果

2.1宫颈癌患者、CINⅢ患者和健康对照者外周血PD-1含量

本研究所采用的流式细胞术以FS-SSC设门(图1A)，每次实验均做同型对照，控制值约为0.5%(图1B)。宫颈癌患者外周血PD-1水平为((15.23±1.05)%)，CINⅢ患者为((8.64±0.53)%)，正常健康对照者为((5.93±0.24)%)(图1C1 -C3)。3组数据经方差分析结果显示，差异有统计学意义，F=763．84，P<0.01。采用LSD-t检验进行两组间两两比较，结果显示宫颈癌患者外周血PD-1含量高于CINⅢ患者(t=5.61,P<0.01)及正常健康对照者(t=7.87，P<0.01)，CINⅢ患者PD-1含量高于正常健康对照者(t=4.76，P<0.01)。

2.2宫颈癌患者外周血PD-1含量与临床病理特征的关系

宫颈癌患者外周血PD-1水平Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(t=-3.46,P<0.01)，淋巴结转移患者高于未见转移的患者(t=-2.29,P<0.05)。宫颈癌患者外周血PD-1含量在肿瘤不同分化程度(t=0.62,P>0.05)及病理类型(t=-0.32,P>0.05)分组间无统计学差异。结果见表1。

2.3外周血PD-1对宫颈癌的诊断价值

对宫颈癌患者血液PD-1含量结合健康对照组做ROC曲线，其曲线下的面积(AUC)为0.925。根据ROC曲线选择15.07%为临界值时，灵敏度和特异度分别为75.12%和88.47%。

表1　　　　宫颈癌患者外周血PD-1含量与临床病理特征的

3讨论

PD-1是近年来发现的负性协同刺激分子，最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中利用消减杂交的方法得到的，大多数表达于活化T细胞、B细胞、巨噬细胞和骨髓细胞。PD-1与其配体PD-L1(B7-H1)或PD-L2(B7-DC)结合后，通过其胞浆尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序传入抑制信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或免疫无能，从而抑制免疫反应，进而促使肿瘤细胞的逃逸[3]。PD-1在肝癌、肾癌、胃癌等患者外周血都有显著表达[4-6]，提示PD-1有望成为癌症诊断治疗又一观察新指标。目前国内外尚未见有关PD-1在宫颈癌患者外周血表达及其临床价值的报道。

注：FS为前向散射光强度；SS为侧向散射光强度；FL2为PE标记PD-1表达荧光强度；FL4为PE-Cy5标记CD3表达荧光强度。

通过检测宫颈癌患者、CINⅢ患者和健康对照者血液PD-1含量，我们发现宫颈癌患者的血液PD-1水平明显高于CINⅢ患者和健康对照者(P均<0．01)，同时CINⅢ患者的血液PD-1水平也是明显高于健康对照者(P<0.01)，这说明了血液PD-1浓度的升高与宫颈癌的发生密切相关，是宫颈癌发生的早期事件。大量临床、分子生物学及流行病学资料已表明，人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌及CIN的主要病因，其在宫颈癌发生发展过程中引起的免疫逃逸机制引起各方研究关注。目前，Yang W等[7]学者分别检测高危型HPV阴性和高危型HPV阳性妇女宫颈上皮细胞的PD-1，发现高危型HPV阳性妇女PD-1的含量显著高于高危型HPV阴性妇女，而且高危型HPV阳性妇女PD-1含量与CIN分级呈正相关性，结果显示PD-1/PD-L1信号途径参与了HPV介导的宫颈慢性炎症到宫颈癌发生发展的病理过程。Chang等[8]研究也发现，生殖器乳头状瘤PD-1+CD4+T细胞复发病灶中显著增加，而且引起Th2细胞的升高，有助于免疫逃逸机制的产生。Karim R等进一步[9]指出，PD-1+CD8+T细胞和PD-1+CD4+Foxp3+T在宫颈癌患者宫颈组织中大量表达，提示阻断PD-1的表达可能是宫颈癌免疫治疗的新途径。关于宫颈癌PD-1国内的报道并不多见，王渝琦等[10]指出表达PD-1 的T细胞凋亡是肿瘤免疫逃逸的原因之一，作者观察了宫颈癌细胞表达PD-1的受体PD-L1 与肿瘤内浸润淋巴细胞凋亡的关系，结果发现部分PD-L1 阳性的宫颈癌病例癌巢和间质内部分淋巴细胞发生了凋亡，故推测癌巢及癌巢边缘浸润的CD8+T细胞减少可能与PD-1/PD-L1途径促进其凋亡有关。有关宫颈癌患者PD-1的研究目前多数集中于宫颈上皮细胞、宫颈癌病理组织这两个载体上。我们的研究发现，PD-1在肿瘤原发病灶的表达可以通过血液循环系统的运转而最终出现在外周血中。对于宫颈癌患者PD-1的检测与追踪复查而言，外周血来源方便，对患者的创伤性小，在某种程度上可以代替宫颈癌组织细胞学的检测。通过进一步分析宫颈癌患者血液PD-1浓度与临床病理特征之间的关系，可以发现Ⅲ+Ⅳ期患者血液PD-1水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(t=-3.46,P<0.01)，差异有统计学意义。分期的进展是预后不良的指标，结果说明了血液PD-1浓度过高预示着疾病进展、预后不良。同时，有淋巴结转移患者PD-1水平也高于无淋巴结转移患者(t=-2.29，P<0.05)。结果表明，宫颈癌患者T 淋巴细胞中高表达的PD-1,与其配体相互作用后,抑制了肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的增殖和活化,使T淋巴细胞处于无能状态,诱导并维持T 淋巴细胞对宫颈癌细胞免疫耐受,从而使宫颈癌细胞有效逃避机体的免疫监控和杀伤,使宫颈癌增殖得不到有效控制,导致宫颈癌的进一步增长,甚至发生转移。而在不同的分化、病理类型之间，则未见PD-1的表达水平发生显著性差异。ROC曲线分析表明，PD-1在早期诊断宫颈癌的发生以及转移具有一定的准确性。在cut-off值为15.07%时，灵敏度为75.12%，特异度为88.47%。我们推测，PD-1有可能作为一种新型的生物标志物在将来单独或与其他肿瘤标志物联合应用于宫颈癌的早期辅助诊断及预后判断。

综上所述，外周血PD-1的变化在宫颈癌的临床分期和侵袭转移中发挥重要作用，有可能为宫颈癌的早期诊断和预后判断提供有力依据。

参考文献：

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[9]Karim R,Jordanova ES,Piersma SJ,et al.Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma[J].Clin Cancer Res，2009,15(20):6341.

[10]王渝琦，徐光旭，耿卫朴，等.人子宫颈癌PD-L1 的表达及其与肿瘤内浸润T 细胞的相关性研究[J].第三军医大学学报,2010,32(11):1173.

Clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in patients with cervical cancer

WUJin-hua1，ZHENBo2，CHENJian-yong1，etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China；2.Departmentofgynaecology,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in the early diagnosis of cervical cancer.MethodsFlow cytometry was available to detect the PD-1 in peripheral blood from 72 patients with cervical cancer,63 patients with CINⅢ and 60 healthy controls，and the correlation of PD-1 and the clinical pathological parameters of cervical cancer was analyzed.The diagnostic performance of PD-1 in peripheral blood for cervical cancer was estimated by receiver operating characteristic (ROC) curve analysis.ResultsPD-1 in peripheral blood from cervical cancer group((15.23±1.05)%)were significantly higher than those of CIN III group ((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)and healthy controls group((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01).Patients of stageⅢandⅣ((16.85±1.74)%)were significantly higher than those of stageⅠandⅡ((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01),patients with lymph node metastasis ((16.56±1.37)%)were higher than those without lymph node metastasis ((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)．PD-1 in cervical cancer patients with different difierentiation degree and histological type showed no significant difference．The area under curve(AUC) of PD-1 in peripheral blood was 0.925.At the optimal cut-off of 15.07%,the diagnostic sensitivity and specificity were 75.12% and 88.47%.ConclusionThe 1evel of peripheral blood PD-1 may benefit the early aided diagnosis of cervical cancer and may play a role in the prognostic judgment．

Key words:uterine cervical neoplasms；PD-1；biological markers；flow cytometry

基金项目：广东省江门市科技计划项目(201471)

文章编号：1007-4287(2016)05-0779-04

中图分类号：R446.1

文献标识码：A

作者简介：伍金华(1979-)，男，36岁，副主任检验技师,硕士，研究方向：外周血PD-1流式细胞术检测。

(收稿日期：2014-12-20)