雪白睡莲花中烟花苷的提取工艺研究

宋敏，李晨阳，谭为，赵军，*，徐芳，敬思群（.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046；.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐830004）

雪白睡莲花中烟花苷的提取工艺研究

宋敏1，李晨阳2，谭为2，赵军2，*，徐芳2，敬思群1
（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046；2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐830004）

摘要：对烟花苷的提取工艺进行了研究。以烟花苷含量为评价指标，考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对烟花苷提取率的影响。在单因素试验基础之上，设计四因素三水平正交试验，确定提取睡莲花烟花苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1∶30（g/mL），提取时间0.5 h，提取次数3次。在此工艺条件下，睡莲花中烟花苷的平均含量为（3.213±0.029）mg/g。

关键词：雪白睡莲花；烟花苷；提取；正交设计

雪白睡莲（Nymphaea candida Presl.）为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物，分布于我国新疆伊犁及博湖地区，主要用于观赏和食用。该植物的干燥花蕾在维吾尔医学中还用于感冒发热、头痛咳嗽、咽痛等病症的治疗，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要成分［1-2］。黄酮类化合物烟花苷是雪白睡莲花中所含的主要特征性成分，具有抗氧化、抗肝炎、神经保护等生物活性［3-6］。然而，对烟花苷的提取工艺研究鲜有文献报道。因此，本论文在烟花苷含量测定的基础上，采用单因素试验结合正交设计考察乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对睡莲花烟花苷含量的影响，优化烟花苷的提取工艺，以期为雪白睡莲花资源的开发利用提供科学参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

睡莲花药材：新疆维吾尔药业股份有限公司提供，新疆药物研究所何江副研究员鉴定为睡莲科植物雪白睡莲（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥花蕾；烟花苷对照品（含量为98.191%）：自制；乙腈和甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司；水：屈臣氏蒸馏水；乙醇、磷酸等其他试剂为国产分析纯。

LC-10ATvp高效液相色谱仪、SPD-10Avp紫外可见检测器：日本岛津有限公司；梅特勒AL204型电子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1烟花苷标准曲线的绘制

1.2.1.1对照品溶液的配制

精密称取烟花苷对照品0.005 0 g，加甲醇定容至25 mL棕色容量瓶中，制备成烟花苷对照品储备溶液（0.20 mg/mL）。

1.2.1.2供试品溶液的配制

取睡莲花药材，粉碎过40目筛，取1 g，精密称定，加入体积分数为70%的乙醇20 mL，精密称重，加热回流提取1次，每次1 h，待放置室温后，加溶剂补足重量，离心，后取上清液2 mL蒸干，加水溶解后至25 mL容量瓶中定容，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。按标准曲线项下的方法测定药材中烟花苷含量。

1.2.1.3HPLC色谱条件

色谱柱：phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈和2 mL/L磷酸二元梯度洗脱，梯度条件：0～5～10～30～60 min，乙腈5%～5%～11%～14% ～20%；2 mL/L磷酸95%～95%～89%～86%～80%；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：266 nm；进样量：10 μL。

1.2.1.4线性关系考察

精密量取烟花苷对照品储备溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10 μL，进样，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），烟花苷质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.1.5精密度试验

精密称取称取本品粉末1g，按“1.2.1.2”中方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按照色谱条件连续进样6次，测烟花苷峰面积的RSD值。

1.2.1.6重复性试验

精密称取称取本品粉末1 g，按“1.2.1.2”中方法制备供试品溶液，共6份，精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样，测定峰面积的RSD值。

1.2.1.7稳定性试验

精密称取称取本品粉末1 g，按“1.2.1.2”中方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0、1、5、7、20、24 h进样，测烟花苷在24 h内峰面积的RSD值。

1.2.1.8回收率试验

精密称取取已知含量的本品约0.5 g，共6份，分别加入烟花苷对照品（0.20 mg/mL）6 mL，按“1.2.1.2”中方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样，计算平均回收率及RSD值。

1.2.2雪白睡莲花中烟花苷提取工艺优化

1.2.2.1乙醇浓度对烟花苷含量的影响

精密称取药材粉末5份，每份0.5 g，分别加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇20 mL，回流提取1次，每次1 h。将提取液补重、离心、过滤，测定烟花苷的含量。

1.2.2.2料液比对烟花苷含量的影响

精密称取药材粉末5份，每份0.5 g，分别加入料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的50%乙醇，回流提取1次，每次1 h。将提取液补重、离心、过滤，测定烟花苷的含量。

1.2.2.3提取时间对烟花苷含量的影响

精密称取过筛睡莲花粉末5份，每份0.5 g，分别加入料液比为1∶30（g/mL）的50%乙醇回流提取1次，回流时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h。将提取液补重、离心、过滤，测定烟花苷的含量。

1.2.2.4提取次数对烟花苷含量的影响

精密称取过筛睡莲花粉末3份，每份0.5 g，分别加入料液比为1∶30（g/mL）的50%乙醇，在95℃水浴锅中分别回流提取1、2、3次，每次1 h。将提取液补重、离心、过滤，测定烟花苷的含量。

1.2.2.5正交试验

在单因素试验的基础上，以料液比、提取温度、提取时间、提取次数对烟花苷的含量有影响的4个因素为变量，每个因素取3个水平，以烟花苷含量为考察指标，采用L9（34）因素水平表选用最佳提取参数，因素水平设计见表1。

表1　正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.2.6验证试验

根据正交试验确定的最佳提取方法进行验证试验，做3组平行试验，测定睡莲花中烟花苷的平均含量。

1.3统计学方法

采用正交设计助手v1.1.0进行统计处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果与分析

2.1烟花苷标准曲线的绘制

按照1.2.1.4的方法配制标准品溶液。精密吸取各对照品溶液10 μL，进样，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），烟花苷质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算线性回归方程，得回归方程为：Y = 21 015 503X+1 793.320 0，R2=0.999 9，样品在0.004 0 mg/mL～0.120 0 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.1精密度试验

精密度试验结果表明，烟花苷峰面积的RSD值为1.5735%，表明测定仪器精密度良好。

2.1.2重复性试验

重复性试验结果表明，烟花苷峰面积的RSD为0.670 0%，表明测定方法重复性良好。

2.1.3稳定性试验

稳定性试验结果表明，分别在0、1、5、7、20、24h时进样，测得烟花苷在24 h内峰面积的RSD为2.155 7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4回收率试验

回收率试验测得烟花苷的平均回收率为99.277%，RSD为1.536%，表明该方法准确可靠。见表2。

表2　加样回收率试验结果Table 2 Results of average recovery

2.2雪白睡莲花中烟花苷提取工艺优化

2.2.1乙醇浓度对烟花苷含量的影响

不同乙醇浓度对烟花苷含量的影响如图1所示。

图1　乙醇浓度对烟花苷含量的影响Fig.1 Influence of ethanol concentration on content of nicotiflorin

结果如图1所示，烟花苷含量随乙醇浓度的增加呈先增加后降低的趋势，在乙醇浓度为50%时，烟花苷含量较高，因此选择乙醇浓度为50%。

2.2.2料液比对烟花苷含量的影响

不同料液比对烟花苷含量的影响如图2所示。

图2　料液比对烟花苷含量的影响Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on content of nicotiflorin

由图2可见，烟花苷含量随着料液比的增加而增加，当料液比大于1∶30（g/mL）时，烟花苷含量的增加量大大降低，从经济成本和大规模生产考虑，最终选择浸提料液比为1∶30（g/mL）。

2.2.3提取时间对烟花苷含量的影响

不同提取时间对烟花苷含量的影响见图3。

图3　提取时间对烟花苷含量的影响Fig.3 Influence of extraction time on content of nicotiflorin

由图3可知，回流提取时间为1 h和1.5 h时，烟花苷含量差异不大。因此提取时间选为1 h。

2.2.4提取次数对烟花苷含量的影响

提取次数对烟花苷含量的影响见图4。

图4　提取次数对烟花苷含量的影响Fig.4 Influence of extraction times on content of nicotiflorin

由图4可知，随着提取次数的增加，烟花苷含量缓慢提高。次数为3时，达到最高。

2.2.5正交试验

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3　正交试验结果Table 3 Orthogonal experimental results

表4　方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

以烟花苷含量为考察指标，通过直观分析中极值R可知，提取次数极差最大，其次是乙醇浓度、料液比、提取时间。而影响烟花苷的提取效果因素大小依次为：提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间。由方差分析可知，提取次数对烟花苷的提取具有显著影响，而乙醇浓度、料液比、提取时间对烟花苷的提取影响较小。通过此正交试验与方差分析，并结合时间成本、经济成本及大规模生产等因素综合考虑，筛选出最佳提取工艺为A3B2C1D3，即提取雪白睡莲花烟花苷的最佳提取工艺为料液比为1∶30（g/mL）的70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h。

2.2.6验证试验

根据正交试验确定的最佳提取方法进行验证试验，准确称量0.5 g睡莲花药材，按1∶30（g/mL）的料液加入70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h，做3组平行试验，测定结果显示睡莲花中烟花苷的平均含量为（3.213±0.029）mg/g；结果表明提取工艺稳定，重复性良好。

3　结论

本试验通过单因素试验考察乙醇浓度、料液比、浸提时间和提取次数对烟花苷得率的影响，并采用正交试验得到提取烟花苷的最佳工艺，即料液比为1∶30（g/mL）的70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h。提取次数对烟花苷的提取率具有显著影响。按照最佳提取条件进行验证试验，睡莲花中烟花苷的含量可达到（3.213±0.029）mg/g。本工艺方法操作简便，成本低，适合工业化生产，结果可为雪白睡莲花的开发利用提供数据基础。

参考文献：

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Optimization of Extraction Technology of Nicotiflorin from Nymphaea candida Presl.

SONG Min1，LI Chen-yang2，TAN Wei2，ZHAO Jun2，*，XU Fang2，JING Si-qun1
（1. College of Life Sciences and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China；2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines，Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，Xinjiang，China）

Abstract：The extracting technology of nicotiflorin from Nymphaea candida Presl. were studied. The nicotiflorin was used to evaluate the effect of ethanol concentration，solid-liquid ratio，extracting time and extraction times on the extracting rate. Based on the single-factor experiment the orthogonal experiments of four factors and three levels were found as follows：the ethanol concentration 70%，olid-liquid ratio 1∶30（g/mL），the extraction time 0.5 h，extraction for 3 times. In the best conditions the content of nicotiflorin from Nymphaea candida Presl. were（3.213±0.029）mg/g.

Key words：Nymphaea candida Presl.；nicotiflorin；extraction；orthogonal experiment

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.029

基金项目：新疆维吾尔自治区科技支撑计划项目（201333118）

作者简介：宋敏（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：药食兼用植物的研究与开发。

*通信作者：赵军（1973—），男（汉），研究员，博士，研究方向：药食兼用植物的研究与开发。

收稿日期：2015-03-18