基于Design- Expert软件设计优化大蒜多糖提取工艺

王富花，董凤凤，张占军，*（.扬州工业职业技术学院，江苏扬州57；.扬州市职业大学，江苏扬州5009）

基于Design- Expert软件设计优化大蒜多糖提取工艺

王富花1，董凤凤2，张占军2，*
（1.扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127；2.扬州市职业大学，江苏扬州225009）

摘要：主要研究大蒜多糖提取的4种影响因素及其交互作用对大蒜多糖提取率的影响，借助于Design-Expert软件设计，优化大蒜多糖提取工艺条件，以期为开发利用大蒜多糖提供参考。采用水煮醇沉法提取大蒜多糖，以苯酚-硫酸法检测其含量，分别考察浸提时间、料液比、浸提温度及浸提次数对大蒜多糖得率的影响。在单因素试验的基础上，利用Design-Expert软件进行四因素三水平Box-Behnken试验设计，建立了大蒜多糖提取率和各因素之间的数学模型。结果表明，提取温度、液料比、提取时间和提取次数的一次项，个别交互项及其二次项对大蒜多糖得率的影响显著，而液料比与提取时间，液料比与提取次数的交互项作用不明显。大蒜多糖提取最优条件最终确定为：提取温度81℃，液料比14∶1（mL/g），提取时间84min，提取次数2次。

关键词：大蒜多糖；Design-Expert；提取工艺；响应面；优化

多糖又称多聚糖（polysaccharides），是由糖苷键结合的糖链，是一类重要的活性生物大分子，一般由10个以上的单糖组成的高分子碳水化合物，多糖广泛分布于自然界中［1］。研究发现，多糖和蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖等生物大分子在细胞与细胞的信息交流、分泌及蛋白质的加工和转移，以及免疫系统分子识别等方面起着非常重要的作用［2］。多糖的性质会随着聚合度的增加，发生较大的变化，其性质和单糖相差也会越来越大，多糖一般为非晶形，没有甜味，难溶于冷水，可溶于热水而不溶于乙醇［3］。植物多糖因其细胞或组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，首先要除去表面脂质（色素、脂肪酸等脂溶性杂质），再用85%乙醇除去单糖、低聚糖和苷类等干扰性成分，然后再用水加热提取，提取液浓缩后加入乙醇进行沉淀即得粗多糖。醇沉的醇浓度根据多糖的结构和性质而不同，一般在70%～85%的范围，也可通过不同的醇浓度分步沉淀多糖［4-5］。

大蒜为百合科葱属植物蒜（Allium sativum L.）的地下鳞茎［7］。中医认为大蒜辛辣、性温、能解滞气、暖脾胃、消症积、解毒杀虫、治积滞、腹冷痛、泄泻、痢疾、百日咳等症［8］。现代医学也证实，大蒜有非常好的防病治病功效。大蒜这些药用保健效果与其所含有的挥发油、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、蒜酶等酶类、凝集素、蒜氨酸及其分解产物大蒜素及多糖等成分有直接或间接的关系［9］。近年来，国内外大量研究证实大蒜多糖（ASP）具有多种生理活性，可控制血脂、可选择性地增殖肠道双歧杆菌、降低血糖、增强免疫功能；能增强T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的活力，具有护肝、抗氧化和抗病毒作用，在保健食品和医药中有着较好的开发前景［1］。大蒜中大蒜多糖的含量较之大蒜功效成分大蒜素高一个数量级，且大蒜素不稳定，需要加工成胶囊或丸剂以保持其药效，因此开发活性大蒜多糖更有优势，经济效益也更为明显［10］。目前国内外对大蒜多糖提取、生物活性方面的研究非常活跃，但关于大蒜多糖提取优化方面的报道仍然较少。

1　材料与仪器

1.1材料

大蒜：购于扬州市邗江区大润发超市。

1.2仪器和试剂

AR2410电子分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂；745型紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；TDL-5000B型离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52AA系列旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；DK-S28型电热恒温水浴锅：上海市精宏实验仪器有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、丙酮、无水乙醇、95%无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

2　方法

2.1水煮醇沉法提取大蒜多糖的工艺流程

大蒜→80℃烘干至恒重→粉碎（孔筛0.5 mm）→石油醚回流脱脂［液料比3∶1（mL/g），时间3 h］→55℃烘干→80%乙醇回流→65℃烘干→粉碎→加水搅拌浸提→离心（5 000 r/min，10 min）→上清液浓缩→加乙醇至75%终浓度→静止过夜→抽滤→滤渣→真空干燥

2.2测定方法

2.2.1大蒜多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法。利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，后与苯酚生成橙黄色化合物［8］。再以比色法测定。

2.2.2葡萄糖标准曲线的制作

取经105℃干燥恒重的葡萄糖500 mg，稀释定容至100 mL，从中取出1 mL溶液加蒸馏水定容至50 mL，此时葡萄糖浓度为0.1 mg/mL，精密吸取以上浓度的葡萄糖标准液各0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL，分别置于20 mL的比色管中，再依次加入蒸馏水使终体积为2 mL，同时吸取2 mL蒸馏水于比色管中作空白对照，然后在以上各管中加入5%苯酚1 mL，摇匀后立即加入5 mL浓硫酸，振荡，室温放置20 min后，用分光光度计在490.0 nm处测定其吸光值。

2.2.3大蒜多糖得率的计算

取干燥大蒜多糖10 mg，定容至100 mL，吸取样品液1.0 mL，加入1 mL蒸馏水，按2.2.2操作，测光密度。

多糖得率Y/%=（WE×CT）/WP×100

式中：WE为的粗提取物的重量，mg；WP为每次试验中使用的预处理样品重量，mg；CT为粗提取物中总糖的含量，%。

2.3单因素试验

应用水提醇沉法提取大蒜多糖，分别考察浸提时间、料液比、浸提温度及浸提次数对大蒜多糖得率的影响。

2.4响应面优化试验

本试验利用Design-Expert软件进行四因素三水平Box-Behnken试验设计，各因素的试验水平及编码见表1。

表1　Box-Behnken响应面试验设计因素水平表Table 1 Variables and levels in Box-Behnken experimental design

试验中考查提取温度、液料比、提取时间和提取次数，对大蒜粗多糖的提取率的影响值。表2列出Box-Behnken试验设计方案及结果（大蒜多糖得率），整个试验共计29组，其中中心点试验重复5组。

3　结果与分析

3.1葡萄糖标准曲线

以糖浓度为横坐标，490 nm处的光吸收值A490为纵坐标，绘制糖浓度-光吸收值标准曲线并回归出相应线性方程。如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

根据葡萄糖标准曲线和样品的吸光值计算出多糖样品中总糖含量。

3.2大蒜多糖单因素试验提取工艺条件的选择

3.2.1浸提时间的选择

取经预处理的大蒜粉碎干品5.0 g，在浸提温度80℃，以液料比15∶1（mL/g），在30、60、90、120、150 min 5个不同的时间条件下提取1次，来确定浸提时间对多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2　提取时间对大蒜多糖得率的影响Fig.2 Effects of extraction time on yield of ASP

由图2可知，随着提取时间的延长，大蒜多糖得率先逐渐增大，再逐渐降低，这可能是随着时间的延长，加快了细胞的破裂，从而使大蒜多糖更好地溶解到水中，多糖得率增大［11］。但时间超过90 min之后，得率增加不明显，而且时间的延长可能使大蒜多糖的结构发生变化，同时综合成本考虑，提取时间在90 min左右为宜。

3.2.2浸提温度对多糖得率的选择

准确称取大蒜干品5.0 g，按液料比15∶1（mL/g）浸泡后，在60、70、80、90、100℃5个不同温度下，通过恒温磁力搅拌器浸提90 min，提取1次后测定多糖含量，结果见图3。

图3　浸提温度对大蒜多糖得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on yield of ASP

由图3可知，不同提取温度对大蒜多糖得率有较大影响，温度过低，不利于多糖物质的溶出；温度过高，容易引起多糖降解。在一定提取范围内，大蒜多糖得率随着浸提温度的升高而增大，得率达到最大值，但超过一定范围后，随着温度的上升，多糖反而有下降的趋势［12］。综合考虑，选择浸提温度为80℃为最佳浸提温度。

3.2.3液料比的选择

取经预处理的大蒜粉碎干品5.0 g，在提取温度80℃条件下，以5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）5个不同的液料比进行试验，确定液料比对多糖得率的影响，结果如图4所示。

图4　液料比对大蒜多糖得率的影响Fig.4 Effects of ratio of water to material on yield of ASP

由图4可知，液料比较小和较大时，多糖得率都有一些偏低，较小时可能是因为溶剂量少使得物料变得黏稠，从而影响了多糖得率；较大时可能是因为溶剂量大给浓缩带来不便，从而导致多糖得率降低。因此，综合考虑，选择液料比15∶1（mL/g）为最佳料液比。

3.2.4提取次数的选择

准确称取大蒜粉碎干品5.0 g，在80℃浸提温度下，以15∶1（mL/g）的液料比进行试验，通过恒温磁力搅拌器浸提90 min，分别浸提1、2、3、4、5次后计算多糖含量，结果见图5。

图5　提取次数对大蒜多糖得率的影响Fig.5 Effects of extraction times on yield of ASP

由图5可知，提取次数的增多能提高大蒜多糖的得率，但提取3次后，残渣中多糖含量明显降低，再增加提取次数已无实际意义，故从节省能耗、减少操作工序以及经济性考虑，优化时提取次数的考察水平分别取1次，2次及3次为宜。

3.3响应面法优化大蒜多糖提取工艺的选择

3.3.1模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析，得到以下二元多次回归方程：

式中：Y表示提取物中多糖的含量，%；X1、X2、X3、X4分别是被测变量提取温度（℃）、液料比（mL/g）、提取时间（min）、浸提次数的编码值。

点击ANOVA选项卡，可以得到模型的方差分析表及模型方程［9］。结果列于表3。

表3　多元回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

从表3可以看出，F-检验显示回归模型有较高的F值（F=68.00）和极低的P值（P＜0.000 1），表明本回归模型是显著的，变异系数（Coefficient of variation）是衡量各观测值变异程度的一个统计量，本模型值为2.38，也表明该模型具有较高的精确性和良好的试验值可靠性。决定系数（R2）反映出回归模型的适合度，R2值越接近于1，则试验值与预测值的相关性越好。本结果决定系数R2值等于0.985 5，表明大蒜多糖得率的试验值与预测值间有较好的一致性；调整决定系数adj-R2等于0.971 0，说明大蒜多糖得率总变异中约97.10%是由独立变量决定的［13］。此外，失拟度（Lack of Fit）是衡量模型在试验范围内不能代表的数据，不包括在模型中不能通过随机误差所解释的回归或者变化的数据。本研究中，失拟度的F值为1.27，P值为0.441 5，失拟度相对于纯误差（pure error）是不显著的，失拟度的不显著使得回归模型具有更高的适合度。预测残差平方和（PRESS）为7.07，说明模型解释变差的能力较强，总体拟合具有统计显著性。同时可以看出，液料比与提取时间，液料比与提取次数间的交互作用不显著。

3.3.2等高线图和响应曲面图分析

响应曲面图（三维）和等高线图（二维）是运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来了解各个变量试验值与响应值之间的关系以及两个被测变量间交互作用的类型，从而选择试验设计中的最优化条件。等高线图的形状（圆形或椭圆形）反应了两被测变量间交互作用显著与否，椭圆形等高线表明两被测变量间交互作用是显著的，圆形等高线则意味着两被测变量间交互作用不显著，可以忽略不计［14］。

点击Model Graphs，在Graphs Tool选项卡中选择3D Surface便会出现收率与各影响因素间的响应面图，从响应面图中可以直观地观察到各因素对收率的影响规律，如图6所示。

图6　各因素对大蒜多糖得率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface plot showing the effect of factors on the yield of ASP

在Graphs Tool选项卡中选择Contour便会出现收率与各影响因素间的等高线图，从等高线图中也可以直观地观察到各因素对收率的影响规律，如图7所示。

利用Design-Expert软件，大蒜多糖提取最优条件最终确定为：提取温度80.9℃，液料比14.5∶1（mL/g），提取时间83.7 min以及提取次数2.18次。在此条件下，大蒜多糖得率预测值为17.12%。考虑到操作的方便性，最优提取参数修正为提取温度81℃，液料比14：1（mL/g），提取时间84 min以及提取次数2次。

图7　对大蒜多糖得率影响的等高线图Fig.7 Contour plot showing the effect of factors on the yield of ASP

在最优提取参数条件下做验证试验，得大蒜多糖的平均得率为16.60%，与预测值17.12%存在较好的一致性。

4　结论

在单因素试验设计的基础上，对大蒜多糖提取工艺条件进行了四因素三水平的响应面法设计，从而建立了大蒜多糖提取率和各因素之间的数学模型。结果表明，提取温度、液料比、提取时间和提取次数的一次项，个别交互项及其二次项对大蒜多糖得率的影响显著，而液料比与提取时间，液料比与提取次数的交互项作用不明显。

利用Design-Expert软件，大蒜多糖提取最优条件最终确定为：提取温度81℃，液料比14∶1（mL/g），提取时间84 min以及提取次数2次。验证性试验结果表明试验值与预测值间存在较好的一致性，说明本研究所得二元多次回归方程是准确的且适用于从大蒜中采用水煮醇沉法提取多糖进行预测。

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Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharide from Allium sativum L. Based on Design-Expert

WANG Fu-hua1，DONG Feng-feng2，ZHANG Zhan-jun2，*
（1. Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2. Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

Abstract：This paper focused four factors and their interactions on the impact of extraction of polysaccharide from Allium sativum L.，while based Design-Expert software design，optimization conditions of polysaccharide extraction，in order to provide the basis for the development and utilization of polysaccharide. Using Design-Ex－pert software for the four factors and three levels Box-Behnken experimental design，the polysaccharide extracted with hot water extraction and alcohol precipitation，the method of phenol-sulfuric acid to detect the polysaccharide content. Meanwhile，extraction time，solid-liquid ratio，extraction temperature and extraction times were investigated on the impact of polysaccharide yield. On the basis of single factor experiments，using Design-Expert software for the four factors and three levels Box-Behnken experimental design，a mathematical model of polysaccharide textraction rate and various factors were created. The results showed that the extraction temperature，ratio of water to marterial，extraction time and extraction times，individual quadratic interaction term and its impact on the polysaccharide yield significantly，while the interaction term of liquid ratio and extraction time，liquid ratio and extraction times were not obvious. Polysaccharide extract optimum conditions eventually identified as：extraction temperature 81℃，ratio of water to marterial 14∶1（mL/g），extraction time 84 min and extracted times was 2.

Key words：polysaccharide of Allium sativum L.；Design-Expert；extraction conditions；response surface methodology；optimization

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.014

基金项目：江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（BK20141269）

作者简介：王富花（1976—），女（苗），副教授，硕士，研究方向：天然产物提取分离纯化。

*通信作者：张占军（1977—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物技术。

收稿日期：2015-03-26