Robo 1蛋白在胃癌中的表达及临床意义

张春煜 孟杰 徐大鹏 张亮

Robo 1蛋白在胃癌中的表达及临床意义

张春煜 孟杰 徐大鹏 张亮

目的 研究跨膜蛋白Robo 1在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 免疫组化P-V法检测54例胃癌和20例癌旁组织中Robo 1蛋白的表达情况及Robo 1蛋白在不同病理特征下的表达；用CD 34标记微血管，计算微血管密度（microvessel density，MVD）探讨胃癌组织中Robo 1与MVD的关系。结果 Robo 1蛋白在胃癌中的阳性表达率为70.37%，在癌旁组织中的阳性表达率为10.00%，两者比较，差异有统计学意义（χ2=21.48，P＜0.05）。Robo 1蛋白的表达水平与淋巴结转移、TNM分期相关，与肿瘤的大小、分化程度无关。Robo 1蛋白在胃癌组织中MVD为（24.74±2.59），与癌旁组织（18.10±1.71）相比显著增高，差异有统计学意义（t=10.629，P＜0.05）。结论 胃癌中Robo 1蛋白表达增高，且与肿瘤的临床病理特征有关，提示Robo 1蛋白在胃癌的形成过程中扮演着重要角色，胃癌中微血管密度增高可以推测出微血管的形成促进了肿瘤的生长与侵袭。

胃癌；Robo 1蛋白；微血管密度（microvessel density，MVD）；免疫组组织化学

Robo 1蛋白是跨膜蛋白Roundabout家族中的一员，另外还有Robo 2、Robo 3、Robo 4，在神经系统中表达的是Robo 1、2、3，参与神经细胞的迁移和调控神经轴突延伸。而Robo 4在血管内皮细胞表面表达，抑制内皮细胞的迁移。此外，Robo家族在非神经系统中也发挥着重要的作用，尤其在一些肿瘤中表达异常，Robo 1启动子甲基化和转录子沉默等表观遗传学的改变，导致了Robo 1表达减少或缺失，提示肿瘤的发生发展与Robo 1失活有关，Robo 1是抑癌基因；也有学者的研究证实Slit 2/ Robo 1可以通过β-catenin/TCF、PI 3K/Akt信号通路及

CXCL 12/CXCR 4、MMPs等信号转导分子促进肿瘤的发生发展。本实验通过检测Robo 1蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达及微血管形成情况，探讨Robo 1蛋白在胃癌形成中的可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2014年1月～2015年9月间辽河油田总医院病理科胃癌切除术标本54例，其中男32例，女22例，年龄39～78岁，平均年龄（45.05±3.73）岁。同时收集20例癌旁组织（距癌变部位边界5 cm以外且经病理证实无癌变的胃粘膜组织），所有患者术前均未接受化疗及放疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm。兔抗人多克隆抗体Robo 1（浓度

1︰50，购自Abcam公司），鼠抗人CD 34抗体由北京中衫公司提供，操作步骤按照P-V 9000试剂盒说明书进行。对照：以PBS代替一抗作为阴性对照；已知阳性片（胃癌）作为阳性对照。

1.2.2 免疫组化结果判读 Robo 1阳性染色为胞浆着色，以阳性细胞数百分率和染色强度得分之和进行评分。高倍镜下随机选取5个视野。（1）按细胞染色深浅评分：0分，细胞不显色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。（2）按阳性细胞比例评分：1分，阳性细胞数占细胞总数<25%；2分，阳性细胞数占细胞总数25%～50%；3分，阳性细胞数占细胞总数51%～75%；4分，阳性细胞数占细胞总数>75%。两值相加≥3分为阳性，＜3分为阴性。

CD 34判断标准为：管腔小于8个红细胞大小的微血管或由内皮细胞形成的条索、腔隙状，染色为棕黄色。首先低倍镜（×10）下找到肿瘤组织血管最密集区域，高倍镜（×40）下计数3个不重复视野内的微血管数，取其平均值作为最终微血管密度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计分析软件，计数资料以百分数和例数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Robo 1蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达及MVD计数Robo 1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为70.37%，明显高于癌旁组织（10.00%），两者比较，差异有统计学意义（χ2=21.48，P＜0.05）。胃癌组织中微血管排列紊乱，大小不一，其MVD为（24.74±2.59）；癌旁组织的MVD为（18.10±1.71），两者比较，差异亦有统计学意义（t=10.629，P＜0.05）。见表1。

2.2 胃癌组织中Robo 1蛋白与MVD计数的关系 38例

Robo 1蛋白阳性表达者，其MVD为（23.16±2.11），阴性表达16例，其MVD计数为（17.94±1.18），两者比较差异有统计学意义（t=9.26,P＜0.05）。

表1 Robo 1蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达及MVD计数结果

2.3 胃癌组织中Robo 1蛋白与临床病理特征的关系Robo 1蛋白与淋巴结转移、TNM分期相关，与肿瘤的大小及分化程度无关。见表2。

表2 Robo 1蛋白与胃癌临床病理特征的关系

3 讨论

许多研究已经证实，Robo 1蛋白在不同的肿瘤中发挥着抑癌基因或促进肿瘤进展的作用[1]。Robo 1蛋白在口腔癌、直肠癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤组织中高表达，促进肿瘤的发生发展，发挥着癌基因的作用[2-5]。在肺癌和乳腺癌中Robo 1蛋白通过交接趋化因子受体4及其配体下游靶向分子的磷酸化，抑制肿瘤的生长[6-7]。本实验中Robo 1蛋白在胃癌组织中的阳性表达为70.37%，高于癌旁组织，且与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移相关，而与肿瘤的分化程度、肿瘤大小无关，推测Robo 1蛋白在胃癌的发生发展中发挥着至关重要的作用。

当实体肿瘤体积小于2 mm3时，肿瘤细胞通过弥散获取营养，大于2 mm3时则必须有新生血管的形成，为肿瘤细胞继续增殖和转移提供氧气和养料。肿瘤血管的形成是由宿主细胞和肿瘤细胞分泌的肿瘤血管生成因子（TAF）引起的，同时减少血管新生抑制物（TIMPs）的表达。新生血管管壁薄弱，只有一层内皮细胞，无平滑肌、神经末梢及相应的淋巴管道，肿瘤血管内皮细胞的细胞器增多，呈现高度扩张的状态；而且新生血管内皮细胞的基底膜不完整，肿瘤细胞易穿透，为肿瘤的增殖及侵袭转移做好准备。肿瘤微血管密度（MVD）是反映肿瘤新生血管的一个重要指标，是评估肿瘤增殖及侵袭的一个重要条件[8]。本实验中胃癌组织中的MVD为（24.74±2.59），高于癌旁组织，进一步证实了微血管形成及增生对肿瘤的生长及侵袭的重要影响。

已有的研究发现，Robo 1作为Slit 2的受体，与Slit 2结合后能够使血管内皮细胞发生迁移，进而促进肿瘤微血管的生成，作为血管形成中的重要通路之一，Slit/Robo这一信号通路具有相对独立性，受血管受体类型及其他信号分子的调控[9-12]。Wang等[13-14]发现肿瘤细胞能够分泌Slit 2，用特异性抗体R 5阻断Slit 2/Robo 1信号通路后,肿瘤血管密度明显降低、肿瘤体积显著缩小。

肿瘤的信号转导异常是肿瘤的发生发展的一个重要因素,虽然研究者己经发现了若干分子在信号传导中发挥着不可替代的作用，但各种分子之间的相互调节机制尚不清楚。本实验中显示高表达的Robo 1蛋白能够促进肿瘤细胞的生长及新生血管的形成，为肿瘤的辅助诊断和抗血管治疗提供了重要的线索。

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Objective To study the Robo 1 transmembrane protein expression in gastric carcinoma tissue and its relationship with clinical pathological features.Methods Immunohistochemical method to detect P-V 54 cases of gastric carcinoma and 20 cases Robo 1 protein expression in tissue adjacent to carcinoma,and compare the different pathological characteristics under Robo 1 protein expression;With CD 34 markers capillaries,microvascular density (microvessel density,MVD),and to discuss the relationship between gastric cancer tissues Robo 1 and MVD. Results The positive expression rate of Robo 1 protein in gastric carcinoma was 70.37%,the positive expression rate was 10.00% in the tissue adjacent to carcinoma,both comparison,difference was statistically significant (χ2= 21.48,P < 0.05).Robo 1 protein expression level and lymph node metastasis and TNM stages related,has nothing to do with the degree of differentiation and tumor size.Robo 1 protein positive MVD in gastric cancer tissue was (24.74 ± 2.59),significantly higher compared with tissue adjacent to carcinoma (18.10 ± 1.71）,with statistical significance (t = 10.629,P < 0.05).Conclusion Higher Robo 1 protein expression in gastric cancer,and is associated with the clinical pathological features of the tumor,prompt Robo 1 protein plays an important role in the formation process of gastric cancer,cancer of the stomach in the microvascular density increased can infer the formation of the microvascular promoted the growth and inasieness of tumor.

Gastric carcinoma; Robo 1 protein; Microvessel density (MVD); Immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.17.002

辽宁 124010 辽河油田总医院 （张春煜 孟杰 张亮） 盘锦骨科医院 （徐大鹏）

张亮 E-mail：huizi 320@163.com