石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量的影响及分子机制的研究

许文胜 康文磊 陈永军 杨增华 张 涛

作者单位：014010 内蒙古包头医学院第一附属医院骨三科



石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量的影响及分子机制的研究

许文胜 康文磊 陈永军 杨增华 张 涛

作者单位：014010 内蒙古包头医学院第一附属医院骨三科

【摘要】目的 观察石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微结构的影响，观察相关细胞的形态学变化，分析探讨其作用机制。方法 将30只雌性KM小鼠按体重随机分为3组：空白对照组、实验对照组、实验组，除空白对照组实施假手术外，其余2组全部在麻醉下切除卵巢制作成骨质疏松症模型，分别给实验对照组和实验组喂食普通饲料和添加一定剂量的石榴籽油的饲料，4周后拟对小鼠股骨近端骨小梁微结构进行检测。同时对4周后3组动物采血获得其血清，利用体外血清培养成骨细胞和破骨细胞，研究3组动物血清对成骨细胞和破骨细胞相关基因表达的影响。结果 实验对照组动物股骨近端骨小梁微结构破坏程度最为严重，其次为实验组，空白组骨小梁微结构正常；石榴籽油代谢物（CLA9C）抑制RANKL诱导破骨细胞的分化，通过增加碱性磷酸酶（ALP）活性和基质矿化促进成骨，同时，主要的转录水平（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN and成骨细胞标记物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈现上调。结论 石榴子油可以抑制雌激素相关的骨质疏松症骨量的丢失同时可以促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性。

【关键词】石榴籽油；雌激素相关骨质疏松症；骨量的影响；分子机制

近年来，有关石榴食用和药用价值的研究越来越为人们所关注，石榴籽油富含不饱和脂肪酸-石榴酸，具备多种药理功能，本研究旨在观察石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微结构的影响，观察相关组织形态学变化，分析探讨其作用机制，为预防和治疗女性绝经后骨质疏松症提供安全、经济、有效的食物或药物做初步探讨。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型、分组和膳食干预

将30只雌性KM小鼠按体重随机分为3组：空白对照组、实验对照组和实验组，除空白对照组实施模拟手术外，其余2组全部在麻醉下切除卵巢制作成骨质疏松症模型，给模拟组和实验组喂食普通饲料和添加5%石榴籽油的饲料，4周后麻醉下处死小鼠，取出双侧股骨加以检测分析。

1.2 组织形态学检测

对实验动物股骨近端进行5 μm厚非脱灰组织切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）进行染色。形态学计量用与光学纤维镜相连的半自动显微图像分析仪（型号：TRH-JX2000A/B），对股骨近端二次海绵骨组织构造，进行定量分析，内容包括骨的骨量/组织量、骨小梁厚度和骨小梁间距，并对酒石酸抵抗性酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞的数目进行测定。

1.3 模型动物体外血清实验

将30只8周龄的KM小鼠（购自内蒙古大学实验动物中心）经过1周的适应性喂养，随机分为2组（n=15），一组是PSO组，另一组是普通对照组，PSO组每天的灌胃剂量为200 μg，对照组使用相同的剂量，10 d后，麻醉下心脏抽血离心（3 000 r/min，5 min室温），去上清液，与同一组动物血清混合，过滤45 μm，分装并储存在-80℃直到细胞使用到培养基为止。

以最适浓度的NF-k B受体活化因子配体（RANKL）作为诱导剂，在体外细胞培养基诱导培养小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞分化为破骨细胞，待破骨细胞分化成熟后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法进行破骨细胞鉴定，并采用real-time PCR方法检测各不同处理组之间，破骨细胞表型基因及功能基因NF-κB受体活化因子（RANK）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、破骨细胞降钙素受体（CTR）、组织蛋白酶K（CTSK）、趋化因子受体CCR2和整合素基因β3 （ITG-β3）的mRNA表达的差异。经过体外特定培养基培养小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，检测细胞的增殖及基因的表达量，对骨碱性磷酸酶（ALP）、骨保护素基因（OPG）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、盘状结构域受体2（DDR2）、Ⅰ型胶原蛋白（Coll1a1）进行检测。

2 结果

详见图1～2。

3 讨论

绝经后骨质疏松症（POP）是老年妇女的常见病和多发病，是以骨量减少，骨小梁微结构破坏，脆性骨折风险性增加为主要特征的全身性骨骼系统疾病［1］。绝经后妇女的卵巢功能减退，骨组织失去雌激素的保护作用，使骨转换率升高，骨吸收增多，骨丢失加速，此过程可持续5～10年，尤以绝经后的前3年骨丢失速度最快。当绝经后妇女的骨量减少，骨密度（BMD）值低于骨峰值2.5标准差（SD）以上即为绝经后骨质疏松，因此雌激素缺乏是骨丢失加快的重要因素。

3.1 雌激素通过受体调节机制发挥直接作用

一方面促进成骨细胞增殖和胶原合成以及与骨矿化相关蛋白的合成，另一方面抑制破骨细胞功能活性，并诱导其凋亡［2］，抑制破骨细胞的形成与骨吸收之间的平衡，此外，雌激素还通过钙代谢激素调节系统影响3种钙代谢激素的分泌；雌激素还可通过下丘脑-垂体-性腺轴系统调节雌激素及受体的合成。通过上述3条途径，雌激素能防治绝经后骨质疏松症。

3.2 植物性雌激素防治骨质疏松的作用

植物雌激素防治骨质疏松作用机制已经研究到分子水平［3］，主要有以下5个方面。（1）ER基因组作用机制：植物雌激素主要通过结合并激活ERα和ERβ发挥骨保护作用，对ERβ的亲和力高于ERα［4］；（2）ER非基因组作用机制：植物雌激素激活细胞膜ER引起细胞内信号途径的激活，如磷脂酶C有丝分裂原激活蛋白激酶（MAP K）的激活；（3）过氧化物酶增殖子激活受体介导机制：过氧化物酶增殖子激活受体（PPARs）是植物雌激素关键性的转录靶受体，也属于核受体超家族，有α、γ和δ（或β）3种亚型，植物雌激素低浓度时以ER介导的作用为主，表现为骨生成增加、脂肪生成减少；高浓度时以PPARγ介导的作用为主，表现为脂肪生成增加、骨生成减少；（4）OPG/RANKL/ANK介导机制［5］：护骨素（OPG）、核因子-κB（受体活化因子RANK及其配体RANKL（RANK ligand）在破骨细胞的生成激活和存活中起重要作用，成骨细胞在骨微环境中对破骨细胞的整体功能发挥直接作用，包括对OPG/RANKL/RANK系统的调节，植物雌激素可能通过OPG/RANKL/RANK系统产生骨保护作用；（5）酶抑制作用机制：已证实异黄酮类是一种酪氨酸激酶抑制剂，介导细胞内钙离子信号途径，抑制蛋白激酶和酪氨酸激酶，从而引起破骨细胞凋亡抑制骨吸收，也可以通过抑DNA拓扑异构酶I的活性来减少破骨细胞形成。

图1 3组动物股骨近端骨小梁微结构变化比较

图2 对特定细胞因子蛋白表达的调节作用

3.3 石榴籽油的结构与理化特性

石榴籽油（PSO）是唯一植物来源的多不饱和共轭脂肪酸，由石榴籽通过化学工艺萃取而来，其主要含有六种脂肪酸：石榴酸、亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸等。而石榴酸是石榴籽油的最主要成分，约占86%。石榴酸的分子结构见图3。

图3 石榴酸分子结构

因石榴酸的结构与共轭亚油酸（CLA）最为接近而将其称为”超级共轭亚油酸”，近些年国内外研究表明，石榴籽油具有多种药理作用，包括抗氧化、清除自由基和抗衰老；抗基因突变与抗癌作用；降低血压、血糖、血脂和抗动脉粥样硬化的功能；雌激素样作用；抗腹泻、抑制大肠杆菌等致病菌的生长及其肠毒素的产生等；其中雌激素样作用在动物实验研究方面表明［6］，以含石榴提取物的溶液喂饲卵巢切除的大鼠，更年期症状得到有效缓解，即大鼠的增重得到控制，子宫重量有所增加，骨质流失受到抑制，抑郁症状减轻，更年期的持续时间缩短，各项骨骼组织参数均接近正常大鼠的水平。石榴缓解更年期综合症的作用与其所含类雌激素物质具有参与脂代谢、保留骨质、增强中枢肾上腺系统的功能和类雌激素样作用有关。

3.4 石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量的影响

石榴富含类固醇激素和植物雌激素，其中植物雌激素对人体具有双向调节作用，即当体内雌激素水平较低时，它们直接与雌激素受体结合发挥雌激素效应；当体内雌激素水平较高时，它们与雌醇竞争性结合雌激素受体，从而表现出抗雌激素作用。雌激素能促进成骨细胞中TGF-β的产生，表明这些生长因子对骨形成有促进作用，雌激素通过这些生长因子的产生，促进骨形成［7］。实验表明［8］，当雌激素缺乏，骨髓单核细胞分泌IL-1和间质细胞分泌IL-6都增多，切除卵巢的患者体内TNF-α和GM-CSF水平升高，接受雌激素治疗的患者TNF-α和GM-CSF恢复到正常水平。以上细胞因子对骨吸收过程有促进作用，雌激素通过抑制上述细胞因子的产生而抑制骨吸收。骨密度是用单位面积或体积内的矿物质含量来表示骨密度测定是直接反映骨矿物质丢失的敏感指标，其在骨量丢失5%时双能X线骨密度仪即可检出。本实验小鼠股骨近端进行5 μm厚非脱灰组织切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）进行染色。形态学计量用与光学纤维镜相连的半自动图像分析仪，对股骨近端二次海绵骨组织构造，进行定量分析表明，石榴籽油具有抑制雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量减少的作用，其抑制骨量减少的作用机制可能与促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞增殖有关。

3.5 石榴籽油抑制骨质疏松症小鼠骨量的丢失分子机制的探讨

Ahmed等研究发现石榴果提取物可抑制软骨外植体中白介素-1β诱导的蛋白多糖的分解。6.25～25 mg、L的石榴果实提取物即可在细胞水平上将白介素-1β诱导的基质金属蛋白酶MMP-1，MMP-3，MMP-13蛋白的表达水平抑制到中等水平［9］。本研究表明，给骨质疏松症小鼠喂食5%石榴籽油饲料，4周后采血，利用体外血清培养成骨细胞和破骨细胞，研究石榴籽油对成骨细胞和破骨细胞相关基因表达的影响。结果表明：石榴籽油可能通过下调破骨细胞的基因表达抑制破骨细胞的活性。在体外血清试验中，通过检测特定破骨细胞分化标记物的表达（MMP9，CTR，和TRAP等）进一步验证了石榴籽油代谢物（CLA9C）抑制RANKL诱导的破骨细胞分化是通过下调其特定地基因来实现的，另一方面，对成骨细胞胚胎前体的MC3T3-E1细胞加以培养，通过增加碱性磷酸酶（ALP）活性和证明基质矿化来推测石榴籽油血清能促进成骨，同时，主要的转录水平因子（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN 和成骨细胞系标记物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈现上调的结果。在培养体系中加入不同比例的石榴籽油和玉米油，通过检测RAW264.7细胞分化因子MMP9，CTR，ITG β3，RANK-RANKL的表达以及MC3T3-E1细胞DDR2，Coll1a1，BSP等的表达证实了石榴籽油对特定细胞因子蛋白的表达具有调节作用。

综上所述，石榴籽油作为石榴果实的重要组成部分，对雌激素相关的骨质疏松症骨量丢失方面具有抑制作用。同时石榴籽油作为一种天然果实成分，有可能成为女性绝经后防治骨质疏松症方面安全、有效而经济的食品或药物之一。

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Molecular Mechanism for Pomegranate Seed Oil Prevents Bone Loss in A Mice Model of Osteoporosis Through the Regulation of Estrogen

XU Wensheng KANG Wenlei CHEN Yongjun YANG Zenghua ZHANG Tao Department of Third Osteology，First Affiliated Hospital of Baotou Medical，Baotou 014010，China

【Abstract】

Objective To study the molecular mechanism for pomegranate seed oil in prevention of bone loss in a osteoporosis mice model. Methods Accordded to the weight randomly divided 30 KM female mice into 5 groups: pomegranate seed oil low，medium and high dose group，normal group，model group，after 4 weeks detected the bone density，mineral structure and affect on uterus. Results Bone mineral density test show that low doses ofpomegranate seed oil obvious decreased estrogen caused by a lack of BMD，middle dose of pomegranate seed oil completely inhibit the decline，high does of pomegranate seed oil compared with normal group，significantly increased bone mineral density，low doses of pomegranate seed oil significantly suppressed spongy bone bone loss，bone trabecular width decreased and the increase of bone trabecular spacing and was completely inhibited by middle dose of pomegranate seed oil，and high doses of pomegranate seed oil significantly increased bone mass and bone trabecular width. Mild，high doses of pomegranate seed oil inhibits a drop in the quality of the uterus. Conclusion Pomegranate seed oil can inhibit bone loss of estrogen related osteoporosis and can promote osteoblast differentiation at the same time，inhibit the osteoclast activity.

【Key words】Pomegranate seed oil，Osteoporosis regulation of estrogen，Prevents bone loss，Molecular mechanism

基金项目：包头市社会发展科技支撑项目（编号：2014S2003-5-12） 内蒙古自治区自然科学基金项目（编号：2014MS0812）

【中图分类号】R3

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2016）03-0187-03

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.03.138