猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立及应用

文/山东绿都生物科技有限公司 李天芝 于新友文山东省滨州畜牧兽医研究院 沈志强



猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立及应用

文/山东绿都生物科技有限公司 李天芝 于新友文
山东省滨州畜牧兽医研究院 沈志强

摘 要为检测商品化猪瘟细胞毒活疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染，根据牛病毒性腹泻病毒5＇端非编码区基因保守序列设计引物，建立了检测牛病毒性腹泻病毒一步法反转录——聚合酶链(RT-PCR)方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对牛病毒性腹泻病毒扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性，对牛病毒性腹泻病毒检测的灵敏性为1pg总RNA量，应用该方法，检测了32批猪瘟细胞毒活疫苗样品，以上结果表明，该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高，可用于猪瘟细胞毒活疫苗中污染的BVDV外源病毒检测。

关键词猪瘟；牛病毒性腹泻病毒；检测

猪瘟(Classical swine fever，CSF)由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪高度传染、致死性疾病，我国将猪瘟列为一类动物疫病[1]。牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以发热、黏膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽、持续性感染与免疫耐受以及怀孕母牛流产、畸胎甚至死胎等为主要特征的牛传染病[2]，我国将牛病毒性腹泻病列为禁止入境的二类检疫对象[3]。BVDV和CSFV同属于黄病毒科瘟病毒属中的成员[4]，BVDV还可引起猪、骆驼、羊、鹿等多种动物感染发病[5]，给各国养殖业造成了严重的经济损失。猪感染BVDV后可产生类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化，怀孕母猪可致流产，产出畸形胎儿[6]，免疫BVDV污染的猪瘟细胞毒活疫苗是猪感染BVDV一种重要途径。BVDV主要通过生产过程中使用的牛血清、胰酶、牛睾丸等材料以及容器、设备污染猪瘟细胞活疫苗。对猪感染BVDV的现状必须有清醒的认识和必要的防控措施。本研究根据GenBank公布BVDV基因序列，针对具有很高保守性的5′端非编码区基因设计1对特异性引物，建立了一种特异、敏感的BVDV检测方法，以确保疫苗的安全、有效，为商品化猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV污染提供一种有效的分子生物学检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株与病料

牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型等均由本实验室保存，32批猪瘟细胞毒活疫苗样品购买自不同厂家。

1.2 工具酶及试剂盒

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司、DNA Marker、PCR相关试剂、限制性内切酶、MD18-T载体、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3 RT-PCR引物设计与合成

参照GenBank中登录的BVDV 5′端非编码区序列，设计1对引物，上游引物：5- AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3′，下游引物：5′- TCTGCAGCACCCTATCAGG-3′，扩增BVDV 5′端非编码区序列244bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒基因组RNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取BVDV的RNA，并提取其他几种病毒的RNA。

1.5 一步法 RT-PCR扩增及条件优化

以RNA为模板进行一步法RTPCR扩增，反应体系为20μL。各参数为50℃逆转录30min，95℃预变性3min，然后进入95℃ 20s、56℃20s、72℃ 20s，共35个循环，最后72℃延伸8min。取5μL产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。同时对各扩增条件进行优化，包括退火温度(50～60℃梯度温度，每2℃为1个梯度)、引物浓度(0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L为1个梯度)等，反应体系均为20μL。

1.6 扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物5μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体在16℃恒温金属浴中过夜连接，转化感受态菌株DH5α。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养18h后用质粒提取试剂盒抽提质粒，用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定，将测序结果与参照的BVDV序列同源性比较。

1.7 特异性试验

分别提取牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型的RNA，用已建立的方法进行扩增。

1.8 敏感性试验

BVDV 病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀释提取病毒基因组RNA，使其分别相当于含有10ng RNA、1ng RNA、100pg RNA、10pg RNA、1pg RNA、0.1 pg RNA的含量，分别进行一步法RT-PCR检测，确定其敏感性。

1.9 重复性试验

用建立的一步法RT-PCR检测方法，检测3份牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.10 猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检测

将购买的32批猪瘟细胞毒活疫苗样品稀释为含有1头份/200μL作为检测样品进行一步法RT-PCR扩增BVDV，同时设立阳性对照和阴性对照。并同时参照相关规程用细胞培养法检验并比较二者的一致性。

图1 牛病毒性腹泻病毒扩增结果

图2 特异性试验

2 结果与分析

2.1 扩增产物的检测及鉴定

PCR扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，在244bp处可见特异性扩增带，与预期大小相符(图1)。挑取PCR鉴定阳性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果显示，插入到T载体的基因片段的核苷酸序列与BVDV(登录号：KJ620017)的序列相似性为100%。

2.2 特异性试验

利用设计的引物和确定的最佳扩增条件分别对牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型的核酸进行一步法RT-PCR。结果6个样品中只有BVDV能扩增出大小为244bp目的片段，而其它均未扩增出相应的片段(图2)，表明本试验建立的方法有很好的特异性。

2.3 敏感性试验

取5μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约244bp附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，引物的一步法RT-PCR检测灵敏度可以达到1pg RNA(图3)。

2.4 重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。

2.5 猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检测

用建立的BVDV 一步法 RT-PCR检测方法，共检测了32批商品化猪瘟细胞毒活疫苗样品，其中有2批有BVDV污染。细胞培养法的检测结果与一步法 RT-PCR检测方法的结果相同。

图3 特异性试验

3 讨论

范学政等[7]用RT-PCR方法对23批次的猪瘟疫苗进行BVDV检测，结果显示，5批次猪瘟疫苗被BVDV污染，污染率达21.74%。范仲鑫等[8]用RTPCR方法对湖南省内销售的10个厂家48个批次的猪瘟细胞苗进行BVDV病毒核酸检测，结果表明，10个厂家的猪瘟细胞苗中有5个厂家检出BVDV核酸阳性，48个批次中有9批次检出BVDV核酸阳性，阳性率为18.75%。因此，必须对猪瘟活疫苗中的BVDV进行严格检验，禁止接种BVDV污染的猪瘟活疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版三部)外源病毒检验方法[9]，对猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检验主要采取细胞培养法，该法操作复杂，耗时间长，传统的两部法RT-PCR检测方法时间长，操作繁琐，需要先反转录成cDNA再进行PCR扩增，本试验建立的BVDV一步法RT-PCR检测方法操作简单，不需要单独做反转录，反转录与PCR扩增一步完成，能在3h内检出BVDV，不仅节省了时间，而且减少了操作步骤，可方便快捷地扩增出目的片段，适合于大规模推广应用[8]。

4 结论

本试验建立的BVDV一步法RTPCR检测方法，共检测了32批商品化猪瘟细胞毒活疫苗样品，其中有2批有BVDV污染，与细胞培养法检测结果一致；所建立的方法为猪场基层兽医工作者开展猪瘟细胞毒活疫苗样品BVDV污染的检测提供了一种简单、有效的分子生物学检测方法。

参考文献：

[1] 国际兽疫局.哺乳动物,禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].3版.农业部畜牧兽医局(译),1996:28～135.

[2] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:538～548.

[3] 中华人民共和国动植物检疫局.中国进出境动物检疫规程手册[M].北京:[出版者不详],1997:132～134.

[4] 杨小燕,魏春华,刘建奎,等.猪源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定[J].中国兽医科学,2011,41(1):9～13.

[5] 王新平,周绪斌.猪感染牛病毒性腹泻病毒的研究进展[J].动物医学进展,1998,19(1):1～3.

[6] 陶洁,廖金虎,张倩,等.猪感染牛病毒性腹泻病毒研究进展[J]. 中国预防兽医学报,2014(5):410～413.

[7] 范学政,宁宜宝,王琴,等.用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J].中国兽医杂志,2010,46(1):8～10.

[8] 范仲鑫,张朝阳,刘道新,等.猪瘟细胞苗污染牛病毒性腹泻病毒情况调查[J].畜牧与兽医,2011,43(7):84～86.

[9] 中国兽医药品监察室.非禽源活疫苗外源病毒检验技术[Z].北京:中国兽医药品监察所,2013.

[10] Alansari H,Brock KV,Potgieter LN.Single and double polymerse chain reaction for detection of bovine diarrhea virus in tissue culture and sera [J]. J Vet Diagn Invest,1993,5(2):148～153.