水产品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR检测方法的建立

蒋 蔚，易 力，陈永军，何再平，白雪瑞，赵梦苏，刘景云，王 权

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2. 洛阳师范学院生命科学学院，洛阳 471022）



水产品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR检测方法的建立

蒋 蔚1，易 力2，陈永军1，何再平1，白雪瑞1，赵梦苏2，刘景云2，王 权1

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2. 洛阳师范学院生命科学学院，洛阳 471022）

摘 要：霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是引起全球范围的食源性疾病的重要病原菌，建立一种能准确鉴别这3种弧菌的方法具有重要意义。groEL基因是包括弧菌属在内的多种细菌检测的分子标记。本研究根据3种弧菌的groEL基因分别设计引物，经PCR扩增及反应条件的优化，建立一种能同时检测这3种弧菌的多重PCR方法。结果表明应用多重PCR技术对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌能分别特异性地扩增出418、644、192 bp的目的片段。检测其他非目标供试菌时，不出现任何扩增条带。敏感性检测结果表明，对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌最低检测限分别为102、102、103CFU/mL。人工染菌水产品检测结果显示，所建立的多重PCR方法能够有效检测出目的细菌，而未染菌组均为阴性。本文通过建立的多重PCR方法实现了对这3种弧菌的同时检测，具有快速、灵敏度高和特异性强等优点，对水产品中这3种弧菌的检测和流行病学调查具有重要意义。

关键词：霍乱弧菌；副溶血弧菌；创伤弧菌；groEL基因；多重PCR

近几年弧菌引起的食源性疾病已成为当今许多国家面临的公共卫生问题，其中霍乱弧菌（Vibrio cholerae，Vc）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）和创伤弧菌（Vibrio vulnficus，Vv）引起的疾病占有很大比例[1]。霍乱弧菌所致的霍乱为烈性肠道传染病，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，曾在世界上发生过几次大流行，至今仍未平息，是我国传染病法规定的甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一[2]。副溶血弧菌对人类危害仅次于霍乱弧菌，副溶血弧菌能够引起多种无脊椎动物致病，包括石斑鱼、九孔鲍和虾，致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛，严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡[3]。创伤弧菌感染的危害不仅引起胃肠炎，还可引起蜂窝织炎和败血症[4]。这些弧菌不仅给养殖业带来巨大的经济损失，还严重威胁人类健康，建立快速、准确的检测方法意义重大。

目前用于弧菌检测的PCR方法有很多种，大量研究证明多重PCR方法在检测特定微生物具有较高的特异性和灵敏性。用于检测弧菌的mPCR方法大多以某些毒力因子为靶基因，如霍乱弧菌的毒力基因ctx、zot和rtx等[5]，副溶血弧菌的毒力基因tdh、trh等[6]，创伤弧菌的毒力基因vvh，rtxA1 和vvp 等[7]，但这些方法容易出现假阳性或假阴性结果。以看家基因（housekeeping genes）为目标基因建立检测方法则可以避免这样的问题，而且建立一种能同时检测所有目标菌株的方法是进一步进行毒力检测的基础。

groEL基因编码分子伴侣GroEL，在维持细胞渗透压方面发挥重要作用，该基因在自然界的普遍性和保守性以及在种间的变异性使其非常适宜作为一种系统发育标记[8]。groEL较16S rRNA和23S rRNA在弧菌属检测中的优势已早有报道[9]。groEL基因作为分子标记已被用于包括弧菌属在内的多种细菌检测[10,11]。本文根据文献[12]分别合成了针对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌groEL基因的3对特异性的引物，先进行单重PCR扩增，在此基础上再对多重PCR的反应体系及条件进行调整和优化。最后以人工接种上述3种菌的文蛤作为检测对象，评价建立的多重PCR技术对样本中病原菌的检测效果，以期建立针对水产品中3种重要弧菌快速、灵敏、特异性强的多重PCR检测方法。

1　材料与方法

1.1菌株 副溶血弧菌ATCC33847购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；副溶血弧菌ATCC17802和创伤弧菌ATCC27562购自美国模式培养物集存库；副溶血弧菌Vp67、Vp246菌株，霍乱弧菌Vc0901、Vc0903、Vc0904、Vcsh1501和Vcsh1505菌株，创伤弧菌Vvsh1207、Vvsh1501、Vvsh1503菌株, 以及大肠杆菌 O157、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为实验室保存株；无乳链球菌为南京农业大学微生物与免疫实验室惠赠。

1.2试剂 蛋白胨、酵母提取物、硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖培养基（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）购自英国OXOID公司；DNA Marker 购自大连宝生物公司；2×PCR TaqMix 购自广州东盛生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自美国Axygen公司；其余试剂为进口或国产分析纯。

1.3引物的设计与合成 根据文献[10,12]报道分别以霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的groEL基因为靶基因设计3对引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，引物信息见表1。

1.4细菌DNA提取 取 1mL 新鲜培养菌液于离心管中，10 000×g 离心2 min，弃去上清，收集沉淀；根据细菌基因组 DNA（TIANamp Bacteria DNA kit，上海天根生物技术有限公司）提取试剂盒说明书提取细菌 DNA，用灭菌水溶解，-20℃保存备用。

表1 本文所用引物Table1 Primers used in this study

1.5单重PCR特异性评价 提取霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌及其他供试菌的基因组DNA作为模板，无菌水为空白对照，分别进行单重PCR检测评价上述3对引物的特异性。各引物进行单重PCR的反应体系：PCRMix 10μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL、模板1 μL、用ddH2O调整终体积至25 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。反应产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳试验，15 min后通过紫外成像系统拍摄电泳图。3种弧菌的PCR反应产物经纯化后送由上海英俊有限公司进行测序。

1.6单重PCR敏感性评价 将TCBS平板上霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌单菌落接种3%牛肉浸膏培养基，200r/min、37℃培养至对数期，在含3% NaCl的LB平板上计数，用无菌生理盐水以10倍梯度稀释，各取1 mL菌液提取DNA作为模板，用3对引物分别进行单重PCR，反应条件同1.5，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 在凝胶成像系统下拍照记录结果。

1.7多重PCR体系优化 多重PCR反应体系优化从退火温度、退火时间和循环参数进行优化。首先对退火温度进行优化，25μL反应体系：Mix 10μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL、模板1μL、用ddH2O调整终体积至25 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，退火温度60℃～70℃，退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。选择最佳反应体系及退火温度后，对退火时间进行优化，退火时间分别设为为30 s、1 min、2 min。最后对循环参数进行优化，将循环参数分别设为20、25和30。

1.8多重PCR引物特异性评价 提取霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌及其他供试菌的DNA，混合后作为模板，无菌水为空白对照，以最佳反应体系进行反应，评价多重PCR的特异性。

1.9多重PCR引物敏感性评价 分别将相同浓度的霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌以等体积混合后，用无菌生理盐水以10倍梯度倍比稀释，各取1 mL提取DNA作为模板，在最佳反应条件下进行多重PCR敏感性的评价。

1.10人工模拟样品的检测 在当地农贸市场采集贝类，在超净台无菌操作剪碎，用高速分散均质机打碎成匀浆，称取10 g样品与90 mL灭菌的3%NaCl碱性蛋白胨水混匀。取过夜培养的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌菌悬液，10倍梯度稀释后分别涂平板计数，确定细菌浓度后将3种弧菌菌悬液浓度调整至1×108CFU/mL。分别取3种弧菌菌悬液100μL加至50 mL含有样品的3%NaCl碱性蛋白胨水中并混匀，未加菌液的含有样品的3%NaCl碱性蛋白胨水混合液作为阴性对照。37℃、200r/min的条件下进行细菌的富集培养，分别在0、2、4、8h取1 mL菌悬液，提取基因组并进行多重PCR方法检测。

2　结果

2.1三种弧菌单重PCR特异性检测结果 在单重PCR特异性结果中，3对引物对目标菌株都分别扩增出了目的条带（图1A、B、C），而其他非目的细菌均未扩增出条带。霍乱弧菌（Vc）、副溶血弧菌（Vp）、创伤弧菌（Vv）扩增的目的条带大小分别为418、644、192 bp。测序结果表明，与这3种菌各自的groEL基因的同源性分别均达到98%以上，结果证实所扩条带均为目的基因，设计的3对引物具有很好的特异性。

2.2单重PCR灵敏度检测结果 对每种弧菌分别进行单重PCR检测，结果表明对霍乱弧菌，副溶血弧菌和创伤弧菌的最低检测限分别为102CFU/mL（图2A）、102CFU/mL（图2B）和103CFU/mL（图2C）。

2.3多重PCR体系优化 当退火温度在60℃～62℃时，有比较明显的3条目的条带（图3A）；当退火时间在30 s和45 s时均有3条目的条带（图3B），考虑检测的快捷原则，退火时间选为30 s；当循环参数在25、30和35时，3条目的条带均较明显，其中循环参数为30时3条目的条带最明显（图3C）。综上所述，用于同时检测霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的多重PCR方法的最佳反应体系为：Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL，模板1 μL，用ddH2O调整终体积至25 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，退火温度61℃，退火时间30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。

2.4多重PCR特异性检测结果 将各菌混合后进行多重PCR检测，目的菌都可以扩增出相应大小的目的条带，非目的基因均没有扩增出条带（图4）。结果表明在多重PCR检测方法中，3对引物都具有较高的特异性，且在扩增混合菌DNA的过程中未发生互相干扰或抑制，进一步说明所建立的三重PCR具有很好的特异性。

图1　霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌单重PCR特异性评价Fig. 1 Specifi city of single PCR for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cusM: DNA 分子量标准(DL 2000). A: 霍乱弧菌 groEL基因扩增. 1～5: 霍乱弧菌; 6～9: 创伤弧菌; 10～13: 副溶血弧菌; 14: 金黄色葡萄球菌; 15: 大肠杆菌; 16: 无乳链球菌; 17: 沙门氏菌; 18: 空白对照B: 副溶血弧菌groEL基因扩增. 1～4: 副溶血弧菌; 5～8: 创伤弧菌; 9～13: 霍乱弧菌; 14: 金黄色葡萄球菌; 15: 大肠杆菌; 16: 无乳链球菌; 17: 沙门氏菌; 18: 空白对照C: 创伤弧菌groEL基因扩增. 1～4: 创伤弧菌; 5～9: 霍乱弧菌; 10～13: 副溶血弧菌; 14: 金黄色葡萄球菌; 15: 大肠杆菌; 16: 无乳链球菌; 17: 沙门氏菌; 18: 空白对照M: DNA Marker(DL 2000). A: PCR for groEL of V. cholerae. 1-5: V. cholerae; 6-9: V. vulnifi cus; 10-13: V. parahaemolyticus; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank controlB: PCR for groEL of V. parahaemolyticus. 1-4: V.parahaemolyticus; 5-8: V.vulnifi cus; 9-13: V.cholerae; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank controlC: PCR for groEL of V.vulnifi cus. 1-4: V.vulnifi cus; 5-9: V.cholerae; 10-13: V.parahaemolyticus; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank control

2.5多重PCR敏感性检测 将相同浓度的3种弧菌混合后，10倍梯度稀释再进行多重PCR检测，结果表明混合后的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌最低检测限仍分别为102、102、103CFU/mL（图5）；与单重PCR灵敏度的检测结果基本相同，结果表明三对引物均具有较高的特异性，且在扩增混合细菌DNA时不会发生互相干扰或抑制试验结果的影响。

图2　单重PCR检测霍乱弧菌（A）、副溶血弧菌（B）和创伤弧菌（C）敏感性评价Fig. 2 Sensitivity of single PCR for the detection of V. cholerae (A), V. parahaemolyticus (B) and V. vulnifi cus (C)M: DNA 分子量标准(DL 2000). 1～4: 细菌浓度 (104～101CFU/mL); 5: 空白对照M: DNA Marker (DL 2000). 1-4: Bacterial concentration were from104to 101CFU/mL; 5: Blank control

图3　多重PCR反应条件的优化Fig. 3 Optimization of reaction conditions for multiplex PCRM: DNA分子量标准(DL2000). A: 不同退火温度下PCR扩增产物. 1: 60℃; 2: 61℃; 3: 62℃; 4: 63℃; 5: 64℃; 6: 65℃; 7: 66℃; 8: 67℃; 9:68℃; 10: 69℃; 11: 70℃; 12: 空白对照B: 不同退火时间下PCR扩增产物. 1,2: 15 s; 3,4: 25 s; 5,6: 30 s; 7,8: 45 sC: 不同循环数下PCR扩增产物. 1,2: 20次; 3, 4: 25次; 5, 6: 30次; 7, 8: 35次; 9, 10: 40次M: DNA Marker (DL2000). A: PCR amplifi cation on the different annealing temperature. 1: 60℃; 2: 61℃; 3: 62℃; 4: 63℃; 5: 64℃; 6: 65℃; 7: 66℃; 8: 67℃; 9: 68℃; 10: 69℃; 11: 70℃; 12: Blank controlB: PCR amplifi cation on the different annealing time. 1,2: 15 s; 3,4: 25 s; 5,6: 30 s; 7,8: 45 sC: PCR amplifi cation on the different number of cycles. 1,2: 20 times; 3,4: 25 times; 5,6: 30 times; 7,8: 35 times; 9,10: 40 times

图4　多重PCR检测霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌特异性评价Fig. 4 Specifi city for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cus by multiplex PCRM: DNA分子量标准(DL2000); 1: 霍乱弧菌+副溶血弧菌+创伤弧菌; 2: 霍乱弧菌+副溶血弧菌; 3: 副溶血弧菌+创伤弧菌; 4: 霍乱弧菌+创伤弧菌; 5: 副溶血弧菌; 6: 霍乱弧菌; 7: 创伤弧菌; 8: 大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌; 9: 空白对照M: DNA Marker (DL2000); 1: V. cholerae+V. parahaemolyticus+V. vulnifi cus; 2: V. cholerae+V. parahaemolyticus; 3: V. parahaemolyticus+V. vulnifi cus; 4: V. cholerae +V. vulnifi cus; 5: V. parahaemolyticus; 6: V. cholerae; 7: V. vulnifi cus; 8: Escherichia coli+Staphyloccocus aureus +Staphyloccocus aureus; 9: Blank control

图5　多重PCR检测霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌灵敏度评价Fig. 5 Sensitivity of multiplex PCR for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cusM: DNA分子量标准(DL2000); 1～4: 细菌浓度 (104～10 CFU/ mL); 5: 空白对照M: DNA Marker (DL2000); 1-4: Bacterial concentration was from 1×104to 10 CFU/mL; 5: Blank control

2.6人工污染样品检测结果 对人工污染的样品进行培养来富集细菌，分别在不同的培养时间取1 mL菌液提取DNA，用多重PCR方法进行检测。未加菌的样品作为空白对照，没有扩增出任何条带，确定样品在处理前未被3种弧菌污染。富集0 h后提取的DNA扩增出3条目的条带，但比较模糊，培养2 h时提取的DNA经检测有比较明显的条带，随着培养时间的增加，目的条带也逐渐变亮（图6），说明所建立的多重PCR方法可有效的检测贝类样品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。

图6　多重 PCR对人工污染样品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的检测结果Fig. 6 Detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cus in inoculated samples by multiplex PCRM: DNA分子量标准(DL2000); 1～5: 细菌富集培养时间为8、6、4、2、0 h; 6: 空白对照M: DNA Marker(DL 2000); 1-5: The time for enrichment culture were 8, 6, 4, 2, 0 h; 6: Blank control

3　讨论

食源性致病菌严重威胁公众健康，并且给很多国家带来严重的经济损失[13]，因此建立简单、快速和灵敏的检测方法非常重要。靶基因的选择对检测特定种群的细菌至关必要。目前很多方法选择毒力基因为靶基因用于致病菌株的检测，但是在疾病暴发或样品筛选的过程中，首要任务是在物种水平上确定细菌，大多数环境菌株不一定具有所检测的毒力基因[5-7,12]，而且在自然环境中，亲缘关系较近的弧菌中的毒力菌株具有将毒力基因水平转移到非毒力菌株中的流行潜力[14]，因此仅以毒力基因为靶基因的检测方法可能会导致漏检。

目前基于一些看家基因，如dnaJ、amiB、rpoA 和gyrB等靶基因建立的多重PCR方法，用于检测多种弧菌，这些方法各有优缺点，但是常常在检测混合菌种时结果不太理想[15-17]。Pinto等[18]在2005年建立的一种以胶原酶为靶基因的多重PCR方法，对检测弧菌具有较高的特异性，但是不能用于检测对人体健康有较大威胁的创伤弧菌。研究表明，groEL基因是多种细菌种特异性检测的一个很好的靶基因。本试验用groEL基因作为靶基因，分别针对副溶血弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌合成了3对特异的引物，所建立的多重PCR方法针对这3种弧菌可分别扩增出大小不同的产物，通过核酸胶很容易分开，而且非目标菌株均不能扩增出目的条带。多重PCR扩增出来的目的条带和相应的单重PCR条带大小相同，而且单重PCR的特异性和灵敏度均与多重PCR一致，说明该方法的可靠性。有研究表明应用PCR检测食品中的微生物常受到抑制剂的影响，细菌经过培养后在富集目标菌的同时，还可以降低抑制剂的干扰作用[19]。本文所建立的多重PCR可有效的检测人工污染的水产品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，证实所建立方法的特异性和准确性。

总之，本试验建立的多重PCR方法对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌可进行同步检测，具有较高的灵敏性和特异性，为开展水产品中上述弧菌的检测和流行病学调查提供参考。

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·研究论文·

DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO CHOLERAE AND VIBRIO VULNIFICUS IN AQUATIC FOODS

JIANG Wei1, YI-Li2, CHEN Yong-jun1, HE Zai-ping1, BAI Xue-rui1, ZHAO Meng-su2, LIU Jing-yun2, WANG Quan1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang 471022, China)

Key words:Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnifi cus; groEL gene; Multiplex PCR

Abstract:Vibrio cholerae (Vc), Vibrio parahaemolyticus (Vp) and Vibrio vulnifi cus (Vv) are of major concerns in aquatic food industry as they are important pathogens causing food-borne diseases throughout the world. Therefore, it is very necessary to develop an effective multiplex polymerase chain reaction (PCR) for the simultaneous detection of these important Vibrio species. The groEL gene is a potential marker for simultaneous detection of these species in seafood samples. Three sets of species-specifi c primers were designed to develop a multiplex PCR. The reaction conditions of the multiplex PCR were optimized to establish a rapid, sensitive and convenient PCR method. The results showed that the multiplex PCR produced amplicons with expected sizes of 418 bp, 644 bp and 192 bp specifi c for Vc, Vpand Vv, respectively. This PCR method showed good effi ciency as it detected three species in the same samples. The detection limits were demonstrated to be 102CFU/mL for Vp and Vc and 103CFU/mL for Vv in the mixed DNA samples. In addition, the multiplex PCR specifically amplified target species but did not cross-react with other Vibrio and non-Vibrio species. The results indicated that the multiplex PCR was a quick and cost-effi cient method for detection of Vibrio species in seafoods and for epidemiological investigation.

中图分类号：S852.612

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0044-08

收稿日期：2015-10-27

基金项目：上海市科学技术委员会科研计划项目（13DZ0502702）；公益性行业(农业)科研专项（201303045）

作者简介：蒋蔚，女，博士，主要从事微生物学和免疫学研究

通信作者：王 权，E-mail：wangquan@shvri.ac.cn