灵芝孢子粉对乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用*

胡宗苗　刘景楠　周园里　邓颖颖　刘继平

陕西中医药大学药学院 (咸阳 712046)



灵芝孢子粉对乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用*

胡宗苗刘景楠周园里邓颖颖刘继平△

陕西中医药大学药学院 (咸阳 712046)

摘要目的：探讨灵芝孢子粉对乙醇诱导的小鼠胃溃疡的保护作用。方法：BABL/C小鼠灌胃给予0.2mL乙醇制备酒精性胃溃疡模型。随后将小鼠随机分为空白组、模型组、奥美拉唑组(2 mg/kg)、灵芝孢子粉低、高剂量组(0.5 g/kg、1g/kg)，各给药组造模前1h给予药物，造模后4h取血清测定SOD、MDA、IL-6、TNF-α，胃组织HE染色观察病理学改变，蛋白免疫印迹法检测胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白表达。结果: 灵芝孢子粉对乙醇所致胃溃疡病理学改变有所减轻，可有效降低小鼠胃溃疡指数，显著提高血清中SOD水平，降低MDA及IL-6、TNF-α水平，减低NF-кBP65、COX-2蛋白表达。结论：灵芝孢子粉对乙醇诱导的急性胃溃疡有一定保护作用，主要通过抗氧化及抗炎机制。

主题词 胃溃疡/中医药疗法@灵芝孢子粉动物实验小鼠

大量酗酒或饮用高浓度酒可引起浅表性溃疡或急性胃黏膜糜烂，被称为急性酒精性胃溃疡，属胃粘膜急性受损的常见类型。因日常饮酒后酒精30%在胃吸收，故此直接对胃产生损伤，志愿者内镜检查发现单次大量饮酒可能导致胃黏膜糜烂甚至出血[1]。体内外H2O2、氧化应激、缺血缺氧等刺激均可激活核转录因子NF-кB，在炎症中起至关重要的作用。炎症因子COX-2则可被脂多糖、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、血小板生长因子及其他因素诱发并经p38MAPK信号系统级联传递而产生[2]。灵芝孢子粉是灵芝生长成熟后所散发出来的孢子体，富含多种氨基酸，脂肪酸，多糖肽，有机锗及微量元素。临床报道其可改善免疫功能，减轻癌症患者放、化疗不良反应。而药理研究也表明，灵芝孢子粉可增强免疫，抑制多种移植性动物肿瘤。本研究采用乙醇制备小鼠急性胃溃疡模型，探讨灵芝孢子粉对其保护作用及机制。

1材料和方法1.1药物与试剂全破壁赤灵芝孢子粉，购于吉林省长白工坊科贸有限公司(批号: 20140903)。给药前无菌蒸馏水溶解干粉，配置成浓度1g/mL的液体。丙二醛(MDA)试剂盒(20141105)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(20141110)，白介素-6(IL-6)测试盒(20141030)、 肿瘤坏死因子(TNF-α)测试盒(20141030)，均购自南京建成生物工程有限公司； COX-2、NF-кB抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；乙醇购自于吉林省金泰化学试剂有限公司。

1.2动物BABL/C小鼠，雌性，体重18～22g，第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2012-006；动物分笼饲养于陕西中医药大学中药药理实验室。

1.3仪器 酶标仪(KX-21，美国SYSMEX)，Mini-Protean Tetra垂直电泳槽(美国伯乐)、Trans-Blot SD半干转印槽(美国伯乐)、TS1-000脱色摇床(其林贝尔)、702超低温冰箱(美国热电)、TGL-16M高速冷冻离心机(湖南湘仪)。

1.4方法1.4.1造模与给药:取小鼠50只，随机分为空白组、模型组、奥美拉唑组、灵芝孢子粉低、高剂量组，每组10只，除空白组外其余各组灌胃给予乙醇0.2mL/只，各给药组分别在给予乙醇前1h分别给予奥美拉唑(0.02 g/Kg)、灵芝孢子粉 (0.5g/Kg，1g/Kg)，4h后结束实验，取血清及胃组织测定各项指标。

1.4.2指标检测:严格按照试剂盒说明书检测血清中SOD、MDA、IL-6、TNF-α含量； 4%多聚甲醛固定胃组织，石蜡包埋，切片并行HE染色，光镜下观察胃组织病理改变。Western blot：冰冷裂解液处理胃组织并收集总蛋白，进行常规SDS-PAGE，转印至PVDF膜上；室温封闭2h之后分别与NF-кBP65、COX-2一抗孵育，漂洗膜后与辣根过氧化物酶偶联的二抗反应，结束后采用增强化学发光法( ECL) 发光试剂显影，光密度值用灰度成像软件(UVP，UK) 测定并计算NF-кBP65、COX-2蛋白表达。

2结果2.1血清SOD、MDA含量与空白组比较，乙醇诱导的模型组小鼠血清SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.01)，而灵芝孢子粉组小鼠血清SOD活性显著升高(P<0.05或P<0.01)，MDA含量显著下降(P<0.01)，结果见表 1。

2.2 血清IL-6、TNF-α含量与空白组比较，乙醇诱导的模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量明显升高(P<0.05)，而灵子孢子粉组小鼠血清IL-6、TNF-α含量明显降低(P<0.05)，结果见表 2。

2. 3胃组织病理学胃组织病理学检查结果显示，空白组小鼠黏膜层组织结构层次清楚，上皮完整，连续性好，腺体排列整齐。模型组小鼠可见部分黏膜上皮细胞受损脱落，腺体肿胀，结构破坏，凝固性坏死，有灶状糜烂出血，固有膜毛细血管扩张充血，但未累及黏膜肌层，灵芝孢子粉组上述变化明显减轻，见图1。

表1　灵芝孢子粉对血清 SOD、MDA 的影响

注：与模型组比较:△P<0.05, ▲P<0.01

表2　灵芝孢子粉对IL-6和TNF-α的影响

注：与模型组比较: △P<0.05, ▲P<0.01

2.4胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白水平与空白组比较，乙醇诱导的模型组小鼠胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白水平显著升高(P<0.05)；灵芝孢子粉组胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白水平明显降低 (P<0.05)，结果见图2及表3。

A.空白组; B.模型组; C.奥美拉唑组(0.02g/Kg); D.灵芝孢子粉组(0.5g/Kg); E. 灵芝孢子粉组(1g/Kg)

A.空白组; B.模型组; C.奥美拉唑组(20mg/Kg); D. 灵芝孢子粉组(0.5g/Kg); E.灵芝孢子粉组(1g/Kg)

图2　胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白表达

注：与模型组比较: △P<0.05, ▲P<0.01

3讨论酒精具有很高的亲脂性和脂溶性，可刺激胃酸分泌，增加 H+反弥散，损伤正常代谢进而破坏细胞功能，破坏胃黏膜内及黏膜下组织结构，是重要的胃黏膜攻击性因子[3]，故大量酗酒或饮用高浓度酒均可引起急性胃黏膜浅表性损害。研究显示，在绝大多数致溃疡因子的致病过程中有氧自由基的参与，其机制可能与共价键结合性损伤和脂质过氧化损害有关。氧自由基引起脂质过氧化反应形成相应的产物MDA，MDA 可与蛋白质、核酸等大分子结合形成脂褐质沉积于细胞中，造成细胞损伤，而人体内有完善的自由基清除系统，SOD即是其中的重要酶类[4]；NF-кB是炎症反应最为重要的转录因子，可介导IL-6、IL-1、TNF-α等重要的促炎细胞因子分泌，这些因子的大量合成与释放会造成炎症反应[5-7]，而COX-2则可促进炎症介质PG生物合成，引起炎症。

灵芝孢子粉是灵芝成熟后散发出的孢子体，临床报道其可改善机体的免疫功能，防治癌症等作用。本文采用灌胃乙醇建立小鼠酒精性胃溃疡模型，评价灵芝孢子粉对酒精性胃溃疡的保护作用并探讨其初步机制，研究结果显示，灵芝孢子粉能显著提高乙醇诱导的急性酒精性胃溃疡模型小鼠血清中SOD活性；降低MDA及炎症因子IL-6、TNF-α含量，显著改善模型小鼠胃粘膜的病理改变，同时降低胃组织中NF-кBP65、COX-2蛋白表达水平，提示灵芝孢子粉可能是通过抗氧化及抗炎等环节发挥胃粘膜保护作用。

参考文献

[1]姚希贤．临床消化病学[M].科学技术出版社，1995:489-489.

[2]刘宁宁,王炎,吴琼, 等.健脾解毒方介导p38MAPK/ATF-2信号通路抑制幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞COX-2表达[J].中国中西医结合杂志,2011, 31(7):926-931.

[3]王慧,甘超汝,张杰,等.参积护胃颗粒对无水乙醇诱导大鼠实验性胃溃疡的保护作用研究[J].中南药学,2014,12(4):315-318.

[4 ]祁大庆,张晓丽,傅迎.养胃颗粒对实验性胃溃疡大鼠血清 SOD 活性和 MDA 含量的影响[J].现代实用医学,2014,26(4):432-433.

[5]黄玉芳.病理学[M]. 中国中医药出版社,北京:2012:347.

[6 ]姜辉,汪永忠,刘晓闯,等.三七总皂苷对肝纤维化大鼠细胞因子的影响[J].中药材,2013,36(7):1123-1127.

[7]李爱欣,许利婷,张术影.松杉灵芝发酵物对乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用研究.食品与发酵科技, 2015,51(3): 37-40.

(收稿2015-12-03；修回2016-01-13)

Lingzhi Baozifen(LZBF) attenuates stomach inflammation induced by ethanol in mice

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Hu ZongmiaoLiu JingnanZhou Yuanlietal

ABSTRACTObjective：To determine the protective effect of Lingzhi Baozifen(LZBF) on stomach inflammation induced by ethanol in mice. Methods：The BABL/C mice were randomly allocated into control, ethanol, omeprazole (0.02g/kg)、LZBF (0.5g/kg), and LZBF (1g/kg). The blood samples were analyzed for the superoxide dismutase (SOD)、methane dicarboxylic aldehyde (MDA)、interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and the stomach samples were taken for histologic evaluation. The protein levels of NF-кBP65, COX-2 were detected by Western blot analysis. Results：Pretreatment with LZBF prior to the administration of ethanol significantly induced a decrease in MDA activity and in IL-6, the tumor neurosis factor-α (TNF-α) in serum and NF-кBP65 protein and COX-2 in lung. At the same time, pretreatment with LZBF also significantly improved the superoxide dismutase (SOD) activity in stomach. Conclusion:These results showed that anti-inflammatory effects of LZBF against the Alcoholic gastric ulcer.

KEY WORDSStomach ulcer/traditional Chinese medicine therapy@Lingzhi BaozifenAnimal experimentation Mice

【中图分类号】R573.1

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.049

*陕西省教育厅重点科研计划(15JS022)

△通讯作者