UPLC-MS/MS法测定复方黄芩片中黄芩苷在大鼠血浆中的浓度*

王浩宇　张江琳　李　丹　杨相笛　罗　宁　石　磊　陈　悦

西安交通大学口腔医学院牙周粘膜科(西安710004)



UPLC-MS/MS法测定复方黄芩片中黄芩苷在大鼠血浆中的浓度*

王浩宇张江琳李丹杨相笛罗宁石磊陈悦△

西安交通大学口腔医学院牙周粘膜科(西安710004)

摘要目的：建立UPLC-MS/MS方法测定复方黄芩片中黄芩苷在大鼠血浆中的浓度。方法：建立黄芩苷含量测定的UPLC-MS/MS外标分析方法。色谱柱采用C18色谱柱，流动相采用含0.1%醋酸的水-含0.1%醋酸的乙腈，梯度洗脱，在电喷雾电离(ESI)正离子模式下，采用多重反应监测模式(MRM)进行检测。采用清洁级雄性SD大鼠8只，7周龄，体重200±20g，给予复方黄芩片灌胃后(相当于黄芩苷含量200mg/kg)于0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24h时间点用断尾法取血0.4 mL , 置于肝素化的离心管中，5000 r/min 离心10 min，分离提取血浆，采用UPLC-MS/MS法测定血浆中黄芩苷的含量。结果：血药浓度测定结果表明，黄芩苷的线性范围为5～2000 μg/L，定量下限为5μg/L。低、中、高3种浓度的日内和日间精密度相对标准偏差(RSD)不大于3%，平均回收率均在80%以上。黄芩苷血药浓度较低，血药浓度-时间曲线表现为多峰现象。结论：实验建立的UPLC-MS/MS方法符合生物样品分析的要求，可用于研究大鼠灌胃复方黄芩片后血浆中黄芩苷的测定。复方黄芩片口服后其主要药理成分黄芩苷的血药浓度较低，提示药物的吸收利用较差。

主题词黄芩苷/分析@UPLC-MS/MS血药浓度

中药黄芩为唇形科植物黄芩的根，其味苦、性寒，归心、肺、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，主治温热病、肺炎、肺热咳嗽、上呼吸道感染、咳血、高血压、目赤、湿热黄胆、痢疾、痈肿疖疮、胎动不安、泌尿系统感染、肝炎等症。药物有效成分为黄酮类化合物，其中以黄芩苷的药理作用最强，是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成分。黄芩苷的药理学研究报道显示，其具有显著的生物学活性，具有抑菌、抗炎、抗变态反应、利尿、利胆、解痉、解热、降压、镇静等作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能，在抗感染、抗氧化、抗肿瘤、抗HIV以及治疗心血管疾病等方面具有潜在的开发应用价值。

复方黄芩片为利用现代药物萃取技术制成的浓缩糖衣片，主要成分有黄芩、虎杖、穿心莲、十大功劳，辅料为蔗糖、氢氧化铝。该药主治急、慢性咽喉炎, 还对口腔溃疡、泌尿系感染、上呼吸道感染、肠炎、外伤感染、痔疮感染等也有一定疗效。目前，该药临床多应用于消炎解毒、凉血消肿、咽喉肿痛、口舌生疮、感冒发热、痈肿疮疡等。

有关黄芩苷体内分析方法的研究，文献报道有HPLC法[1-3]、LC-MS法[4-5]等。HPLC法灵敏度低，最低检测限较高，而LC-MS法灵敏度高，能很好地应用于黄芩苷的定量分析。本研究将从其血药浓度的测定方面来探讨复方黄芩片在临床中的应用。

1材料1.1 药品与试剂复方黄芩片(广东肇庆星湖制药有限公司，批号：131008)；黄芩苷标准品(中国生物药品检定所)；甲醇、乙腈(高效液相色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；醋酸(质谱纯，美国Waters公司)；肝素钠注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司)；维生素C注射液(上海现代哈森药业有限公司)；水为纯净水。

1.2实验动物清洁级雄性SD大鼠24只，7周龄，体重200±20g，动物购买于西安交通大学医学院实验动物中心，于标准环境下适应性饲养1周后实验。

1.3仪器及条件Waters Acquity 高效液相色谱仪、Waters Xevo-TQD三重四级杆质谱仪(美国Waters公司)。

色谱-质谱条件：采用Waters Acquity UPLC C18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，流动相：A相为0.1%醋酸的水溶液，B相为0.1%醋酸的乙腈溶液，流动相比率改变：初始80%A，0～0.5min 40%A，0.5～1.0min 20%A，1.0～1.5min 40%A，1.5～2.0min 60%A，2.0～2.5min 80%A，2.5～3.0min 80%A，流速为0.2mL/min。柱温为40℃。电喷雾离子化，采用正离子MRM检测模式，用于定量的MRM检测离子为：黄芩苷为[M+H]+446.78→270.77。锥孔电压为35V，碰撞能量为39eV。进样量5μL。

2实验方法2.1溶液的制备对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷标准品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，加8mL甲醇溶解黄芩苷标准品，再加甲醇定容至10mL，摇匀，配制成浓度为1mg/mL的黄芩苷标准品储备液。用甲醇梯度稀释黄芩苷标准品储备液，配成浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000、1500、2000ng/mL的系列黄芩苷标准品品标准溶液。

2.2血浆样品处理方法精密量取0.2 mL血浆，置于1.5 mL离心管中，加入40μL 0.1M盐酸酸化血浆，加入40μL 0.2g/mL维生素C作为抗氧化剂，摇匀，加入1 mL甲醇-乙腈(1∶1)沉淀蛋白，涡旋混合1 min，10000 rpm离心10 min，取上清液，40℃水浴氮气吹干，残渣加0.2 mL流动相涡旋溶解，10 000 rpm离心2 min，取上清液，经C18固相萃取小柱过滤，滤液加流动相稀释至0.5mL，取5μL进样分析。

2.3方法的专属性取空白血浆0.2 mL，按“血浆样品处理方法”项下操作，按照超高效液相色谱质谱联用条件方法进样，得图1A，将一定浓度的黄芩苷标准液加人空白血浆中，依上述方法操作，得图1B，待测物黄芩苷的保留时间为1.25min；取大鼠复方黄芩片灌胃给药后的血浆样品，依上述方法操作，得图1C。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰待测物黄芩苷的测定。

图1　黄芩苷的UPLC-MS/MS图

2.4标准曲线和线性范围将黄芩苷系列标准溶液进样，每个浓度点进行3个样本分析，重复3个分析批，以黄芩苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算得到标准回归方程：Y=77.018X-468.01，r=0.998549，表明黄芩苷浓度在5～2000 ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，定量下限为5 ng/mL。

2.5精密度的考察分别取空白血浆0.2 mL，配制黄芩苷低、中、高3个浓度(浓度分别为10、200、1500 ng/mL)的质量控制(QC)样本，每个浓度进行6个样本，连续测定3d，根据标准曲线计算QC样本的测得浓度，根据测得的QC样品浓度，计算方法的精密度，见表1。

表1　精密度结果

2.6提取回收率考察分别取空白血浆0.2 mL，配制低、中、高3个浓度的QC样本(浓度分别为10、200、1500 ng/mL)，每个浓度进行6个样本分析，以待测溶液的峰面积与相同浓度标准对照品溶液的峰面积的比值作为提取回收率，得到上述3个血浆浓度水平的QC样品中黄芩苷的提取回收率依次为87.85%、83.92%、81.12%。

2.7稳定性的考察分别取空白血浆0.2 mL，配制低、中、高3个浓度的QC样品(浓度分别为10、200、1500 ng/mL)，每个浓度进行3个样本分析，考察其反复冻融3次，以及生物样本处理后室温放置24 h的稳定性，结果表明，黄芩苷血浆样本经反复冻融3次，以及生物样本处理后室温放置24 h均较稳定，测定值与添加值相比较，减少量均在15%之内，见表2。

表2　稳定性结果

2.8动物实验将SD大鼠禁食不禁水12h后，给予复方黄芩片剂量(相当于黄芩苷含量200mg/kg)单次灌胃，灌胃4h后自由进食。在0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24h时间点各采集0.4mL血液，加入肝素钠溶液抗凝，离心后得0.2mL血浆，血浆样品按“血浆样品处理方法”项下进行操作，按照超高效液相色谱质谱联用条件方法进样，测定大鼠血浆中黄芩苷的含量。

3结果

图2　黄芩苷的血药浓度-时间曲线

经过方法验证，本实验的UPLC-MS/MS方法，可快速简便地测量血浆中黄芩苷的含量。

黄芩苷的血药浓度-时间曲线呈多峰形态，结果见图2，药代动力学参数见表3。

表3　黄芩苷药代动力学参数

4讨论黄芩苷可发生氧化反应，在碱性环境中稳定性较差，因此血浆中加入盐酸以酸化血浆，加入维生素C作为还原剂，吹干上清液时采用氮气作为保护气体，可以维持黄芩苷的稳定[6-7]。

在给予大鼠复方黄芩片灌胃后，血浆中的黄芩苷的含量在20min时出现第一个峰值，可能与药物在胃内溶解吸收有关，体现了黄酮类化合物的快速吸收特性；黄芩苷的多峰现象可能与其参与肝肠循环有关[2,8]。黄芩苷先在胃内被初次吸收，之后在小肠内可部分转化为黄芩素被吸收，吸收的黄芩素在组织内又可转化为黄芩苷，且黄芩苷可随胆汁分泌排泄入肠，又能再次被吸收利用。

黄芩苷的血药浓度较低，可能与其低溶解度、低渗透性有关，且复方黄芩片为片剂，黄芩苷在溶解吸收前还需要片剂成分的崩解、药物的溶出，这些原因可能导致其生物利用率较低。提示需增大使用剂量或改进生产制作工艺以取得较好的临床治疗效果。

参考文献

[1] Zeng M, Pan L, Zhu H, et al. Comparative pharmacokinetics of baicalin in plasma after oral administration of Huanglian Jiedu Tang or pure baicalin in MCAO and sham-operated rats[J]. Fitoterapia,2010, 81(6): 490-496.

[2]高荣，龚涛，符垚，等．银黄注射液及口服液中绿原酸和黄芩苷在大鼠体内的药动学比较[J]．华西药学杂志,2007,(03)：283-285．

[3]何心，石跃辉，石春伟，等．黄芩甙在大鼠体内的药动学研究[J]．中国药学杂志,1998，33(4)：232-234．

[4]Zhu Z, Zhao L, Liu X, et al. Comparative pharmacokinetics of baicalin and wogonoside by liquid chromatography-mass spectrometry after oral administration of Xiaochaihu Tang and Radix scutellariae extract to rats[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 878(24): 2184-2190.

[5]车庆明，黄新立，李艳梅，等．黄芩苷的药物代谢产物研究[J]．中国中药杂志,2001,26(11)：46-47．

[6]Xing J, Chen XY, Zhong DF, et al. Stability of baicalin in biological fluids in vitro[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.,2005,39:593-600.

[7]汪祺，张玉杰，李维峰，等.HPLC-电化学检测法用于黄芩苷和黄芩素大鼠血浆稳定性研究[J]．中国中药杂志,2001,33(22)：2675-2677．

[8]Xing J, Chen XY, Zhong DF, et al. Absorption and enterohepatic circulation of baicalin in rats[J]. Life Sciences, 2005，78:140-146.

(收稿2015-12-27；修回2016-01-14)

Determination of baicalin by UPLC-MS/MS in rats plasma administered

with Fufang Huangqin tablets Department of Periodontal and Oral Mucosal Diasease，Stomatology Hospital of Xi’an Jiaotong University College of Medicine(Xi’an 710004)

Wang HaoyuZhang Jianglin Li Danetal

ABSTRACTObjective:Develop a UPLC-MS/MS method to determinating the plasma concentration of baicalin in Fufang Huangqin tablets.Methods:Develop a UPLC-MS/MS analysis method to determining the baicalin. Using C18column,mobile phase uses water containing 0.1% acetic acid - acetonitrile containing 0.1% acetic acid, and use ESI positive ion mode and MRM mode for detection.Using 8 male SD rats, 7 weeks old, weighing 200±20g. Collect 0.4 mL blood from tails at 5,10,20,30,60,120,240,360,480,600,720,960,1440 min after giving Fufang Huangqin tablets orally (Equivalent Baicalin 200mg/kg), and place it in heparinized centrifuge tube, 5000 r/min centrifuge 10 min, separate and extract the plasma for UPLC-MS/MS method to determining plasma concentration of baicalin.Results:The results show that the plasma concentration of baicalin has linear range of 5～2000 μg/L, the detection limit was 5μg/L.Inter-day and intra-day precision RSD of Low, medium, and high concentrations were not more than 3%, the average recovery was above 80%. The blood concentrations of baicalin was low, plasma concentration - time curve shows a multimodal phenomenon.Conclusion:The UPLC-MS/MS method can be successfully used for measuring the concentration of baicalin in plasma of rats.The blood concentrations of baicalin is low, indicating poor absorption and utilization of drugs.

KEY WORDSBaicalin/ Analyti@UPLC-MS/MSBlood drug level

【中图分类号】R283

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.044

* 陕西省科学技术研究发展计划项目(2010K12-01)

△通讯作者

·方药纵横·