三阴乳腺癌组织表皮生长因子受体表达及其与微血管密度和微淋巴管密度的相关性

文显梅　周木秀　郭　勇　党梦婷　赵　旬　余　龙　汪晓铖



三阴乳腺癌组织表皮生长因子受体表达及其与微血管密度和微淋巴管密度的相关性

文显梅周木秀郭勇党梦婷赵旬余龙汪晓铖

【摘要】目的：检测表皮生长因子受体(EGFR)在三阴乳腺癌(TNBC)患者癌组织中的表达及与癌组织中微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLVD的相关性。方法：应用免疫组化法检测48例TNBC癌组织EGFR表达及MVD和MLVD，分析EGFR的表达程度与MVD和MLVD的相关性。结果：TNBC患者癌组织中的EGFR阳性表达率为66.67%(32/48)，其中(+)和(+ +)者各4例(8.33%)，(+ + +)者9例(18.75%)，(+ + + +)者15例(31.25%)，EGFR阳性表达与其MVD 和MLVD呈显著正相关(P<0.01)。结论：TNBC癌组织高表达EGFR及高MVD和高MLVD，从而影响肿瘤生物学行为及患者预后；抗EGFR靶向治疗可能使患者获益。

【关键词】三阴乳腺癌；表皮生长因子受体；微血管密度；微淋巴管密度

三阴乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer，TNBC) 即雌激素受体(ER) 、孕激素受体(PR) 、人表皮生长因子受体2(HER-2) 均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌总数的10%-17%[1]。其发病年龄较早，具有高侵袭性、局部复发和远处转移等特点，预后差。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR) 是存在于细胞膜表面的一种酪氨酸激酶受体，具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK) 活性，可参与正常乳腺组织生长发育调节，对恶性肿瘤细胞的生长调控也起重要的作用。有研究[2]表明，TNBC患者EGFR表达率较非TNBC患者高，可能是TNBC的重要标志物和有效治疗靶点[3]。同时，血管和淋巴管的生成作为肿瘤生长和转移的重要条件已被公认，微血管密度(Microvessel Density,MVD)和微淋巴管密度(Micro Lymphatic Vessel Density,MLVD)业已成为血管和淋巴管生成的两个重要参数,但研究TNBC癌组织EGFR表达与MVD和MLVD相关性的报道尚少。因此，本文观测分析EGFR和MVD、MLVD在TNBC癌组织中的表达及其相关性，进一步探讨TNBC的发生发展机制，为临床治疗提供实验依据。

1资料与方法

1.1病例资料

收集本院于2005-01-01-2015-01-31手术切除的乳腺癌患者乳腺癌标本48例，所有患者均为女性，平均年龄45岁，肿瘤大小约2cm3，术前均未行抗肿瘤治疗，术后常规病理检查显示38例为浸润性导管癌，10例为非浸润性导管癌，免疫组化检查ER、PR及HER-2 均阴性；所有患者均无远处转移，9例患者有同侧腋窝淋巴结转移。

1.2主要试剂和仪器

三种受体检测用鼠抗人单克隆抗体(批号：ER，MAB-0062；PR，MAB-0216；HER-2，MAB-0198)和EGFR鼠抗人单克隆抗体(批号：MAB-0196)以及血管、淋巴管内皮细胞标记用鼠抗人单克隆抗体(批号：CD34，kit-0004；D2-40，MAB-0567)均购自福州迈新公司；免疫组化SP及DAB试剂盒(批号：GK500705、GK417016)购自美国基因公司；PBS缓冲液、EDTA抗原修复液及一抗稀释液均购自北京中杉金桥公司；二甲苯、酒精、双氧水、苏木素均为本实验室制备。El-350-2 石蜡包埋机(Microm公司，德国)；RM2135 切片机(Leica公司，德国)；BM51型倒置显微镜(Olympus公司，日本) 。

1.3检测指标和方法

1.3.1检测方法：所有乳腺组织均以5%甲醛溶液固定，石蜡包埋，3μm厚度连续切片，烤干，于二甲苯溶液及梯度浓度乙醇中脱蜡至水。各免疫组化指标检测步骤按试剂盒说明书操作，采用已知阳性片进行对照，以PBS 液代替一抗作为空白对照。然后依次苏木素淡染细胞核、盐酸酒精分化、返蓝、脱水透明，最后中性树胶封片。

1.3.2ER、PR、HER-2阳性判断标准[4]：ER、PR计数的乳腺癌细胞中，有>10%癌细胞核内见棕色颗粒为阳性；HER-2计数的乳腺癌细胞中，有>10%的细胞膜出现连续性棕黄色为阳性。

1.3.3EGFR阳性判断标准[5]：癌细胞胞质及胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为EGFR阳性细胞，依据阳性细胞着色强度分值和阳性细胞百分率分值之和进行半定量评分。着色强度: 无棕黄色为0分，棕黄色较浅为1分，清晰棕黄色为2分，棕黄色较深为3分。阳性细胞百分率及评分: 先用低倍镜 (×40)寻找到着色最强区域，然后用高倍视野 (×400) 计数400个肿瘤细胞中呈棕黄色的细胞，不见棕黄色细胞计0分，棕黄色细胞< 10%为1分，棕黄色细胞占10%-30%计2分，棕黄色细胞占31%-49%计3分，棕黄色细胞≥50% 计4分。上述两项相加,0-2分者为EGFR阴性(-)，3分及3分以上为EGFR阳性，其阳性程度为3分(+)，4-5分(++)，6分(+++)，7分(++++) 。

1.3.4MVD和MLVD判断标准：按照Weidner等[6]方法，先用低倍视野(×40)找到乳腺癌组织内MVD / MLVD最大的区域，然后换高倍视野(×200)，通过计算机图像分析系统在监视器上计数微血管或微淋巴管数目。CD34染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1支微血管计数，血管管腔面积大于8个红细胞直径者不予计数，每张切片计数5个视野，取平均值作为1例标本的MVD。D2-40染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为一个微淋巴管，每张切片计数3个视野，取平均值作为该标本的MLVD。

以上免疫组化染色结果均由两位具备多年病理诊断经验的技术人员采用双盲法判读。

1.4统计学处理

2结果

免疫组化结果显示ER、PR及HER-2在TNBC患者癌组织中表达均为阴性。

2.1EGFR在TNBC癌组织中的表达

EGFR在乳腺癌中央区和边缘区表达无明显差异。48例TNBC中32例(66.67%)呈阳性表达；有淋巴结转移的9例患者中8 例(88.89%)呈阳性表达，无淋巴结转移的39例患者中24例(61.54%)呈阳性表达。EGFR阳性表达程度分布为：(+) 4 例(8.33%)，(++) 4 例(8.33%)，(+++) 9例(18.75%)，(++++)15例(31.25%)。见图1。

2.2TNBC癌组织的MVD和MLVD

MVD和MLVD在TNBC癌组织癌巢周边较高，EGFR(-)及不同程度EGFR阳性癌组织MVD、MLVD差异有统计学意义(P<0.05),且EGFR阳性程度越高(+—++++)，MVD和MVLD也渐次增加(图2、表1)。等级相关分析表明，EGFR阳性程度与MVD和MLVD 呈显著正相关(rMVD=0.793，rMLVD=0.875，P<0.01)。

表1　不同程度EGFR的TNBC癌组织中MVD和MLVD比较

[本文图1、图2见封2]

3讨论

TNBC作为乳腺癌的特殊亚型，内分泌治疗和靶向治疗均无显著疗效，目前临床主要采用化疗，但是疗效并不理想，病死率高[7]。所以寻找TNBC的有效靶点以及研究其抑制剂已成为近年临床研究新热点。

EGFR 作为一种酪氨酸激酶活性的膜受体，其配体有转化生长因子-2α(TGF-2α)、表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(Amphiregulin，AR)等，配体受体结合形成二聚体，激活内在酪氨酸激酶，促进细胞从G1 期到S 期，从而在细胞增殖中发挥重要作用。已有研究表明，EGFR过度激活可以促使乳腺恶性肿瘤细胞增殖、转移以及肿瘤血管生成并抑制凋亡[8]。

血管生成对恶性实体肿瘤的生长、转移及预后都有相当重要的意义[9]。Sharma 等[10]指出，MVD对预测实体肿瘤侵袭和转移以及预后方面有显著意义。作为目前标记MVD最主要的CD34，其广泛分布于血管内皮细胞，具有较高的特异性和敏感性。还有研究[11]显示乳腺淋巴结转移过程中主要是瘤体边缘功能较强的新生淋巴管起作用，而单克隆抗体D2-40 对淋巴管内皮具有很强的特异性和敏感性[12],可作为理想的淋巴管内皮标记物,而准确计数淋巴管,可作为研究肿瘤淋巴管生成与肿瘤生物学行为间关系的良好指标。本实验结果表明，TNBC患者EGFR阳性表达率是66.67%，且EGFR阳性程度与MVD和MLVD呈显著正相关，证明EGFR确实在TNBC的新生血管和淋巴管形成中起重要作用，与有关研究[13]的结论相一致，也为寻找新的治疗方案提供了依据。有鉴于抗血管疗法具有副作用小，不容易产生耐药性等优点，目前抗血管疗法在肿瘤治疗中已成为新的热点[14]，如抗血管生成联合抗HER-2治疗胃癌即有较好的疗效[15]。目前常用抗EGFR过表达药物有厄洛替尼、西妥昔单抗、小分子酪氨酸激酶抑制剂TKIs等[16]，其对TNBC疗效如何，需要进一步观察验证。

综上所述，本实验结果表明TNBC癌组织的EGFR高表达，MVD及MLVD增加，两者呈显著正相关，为阐明EGFR对TNBC的恶性生物学行为及MVD和MLVD在其中的重要作用，也为临床应用抗EGFR靶向治疗提供了一定的依据。

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文显梅(1978-)，女，汉族，医学硕士，主治医师，主要从事肿瘤病理诊断

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Expression of EGFR and Its Relationship with Microvessel Density and Micro Lymphatic Vessel Density in Triple-negative Breast Carcinoma

WEN Xian-mei,ZHOU Mu-xiu,GUO Yong-Dang,MENG ting,ZAO Xun,YULong,WANG Xiao-cheng

Department of Pathology, The 161st Central Hospital of the People's Liberation Army, Wuhan 430010,China

【Abstract】Objective: To detect the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR)and the correlations with microvessel density(MVD )and micro lymphatic vessel density( MLVD) in triple negative breast cancer( TNBC). Method: Expressions of EGFR, MVD and MLVD were detected in 48 cases of triple negative breast cacer tissues by immunohistochemical method，and the correlation between them was analyzed respectively. Results: The positive rates of expression of EGFR in triple negative breast cacer was up to 66.67%(32/48), in which the (+) and the (++)was 4 cases (8.33%) respectively, the (+++)was 9 cases (18.75%) and the (++++) was 15 cases (31.25%), the expression of EGFR showed significant positive correlation with MVD and MLVD (P<0. 01) .Conclusion: EGFR showed high expression in cancerous tissue of TNBC,which can increase MVD and MLVD in them and affect the tumor biological behavior and prognosis of patients finally. So it is possible that treatment targeting EGFR could make patients with TNBC benefit.

【Key words】Triple negative breast carcinoma;Epidermal growth factor receptor；Microvessel density；Micro lymphatic vessel density

[中图分类号]R737.9

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)02-0005-04

第一作者简介：本文

[作者单位]中国人民解放军第161医院病理科，武汉 430010

本文2015-12-06收到，2016-03-15修回