肉桂精油壳聚糖纳米粒在冷却肉保藏中的应用

刘占东,李　璐，全国芬，丁　武

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100)



肉桂精油壳聚糖纳米粒在冷却肉保藏中的应用

刘占东,李璐，全国芬，丁武

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100)

[摘要]【目的】 制备肉桂精油壳聚糖纳米粒，以扩大肉桂精油(CEO)在冷却肉保鲜中的应用范围，克服其易挥发的缺陷。【方法】 采用离子凝胶法制备肉桂精油壳聚糖纳米粒。通过透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)对肉桂精油壳聚糖纳米粒的形态进行表征，测定其包封率。分别配制质量分数为3%和6%的肉桂精油壳聚糖纳米粒保鲜剂(CEO质量分数分别为0.2%和1.0%)，用其处理冷却猪肉，检测其对肉样色泽(L值、a*值、b*值)、TBARS值、pH和菌落总数的影响。【结果】 制备的肉桂精油壳聚糖纳米粒颗粒大小均匀、形态饱满、呈规则球形，冻干后形态仍较为均匀，包封率为(37.5±2.1)%。通过对冷却肉色泽、TBARS值、pH及菌落总数的分析得知，包埋质量分数1.0%肉桂精油的肉桂精油壳聚糖纳米粒试验组的冷却肉在(4±0.5) ℃时储藏期可达到6 d。【结论】 制备的肉桂精油壳聚糖纳米粒表征良好，可在一定程度上延长冷却肉的贮藏期。

[关键词]肉桂精油；壳聚糖；纳米粒；冷却肉

纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)是运用纳米技术将物质制作成粒径大小在1～100 nm的粒子，其具有表面效应、小尺寸效应、量子效应等特性，表现出许多不同于传统材料的新的物理、化学和生物学特性[1]。将食品材料纳米化，与宏观状态下食品性质与功能相比，可以赋予食品许多优良的性质，包括质构、风味、加工性能以及货架期的稳定性等[2]。因此纳米技术在医药卫生、生物技术、食品工业等领域大放异彩[3]。

壳聚糖(Chitosan，CS)即聚(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是从甲壳素原料中提取出来的一种安全无毒的天然碱性多糖，作为目前自然界中发现的唯一大量存在的阳离子聚合物，壳聚糖具有良好的生物相容性、抗菌性、可降解性和成膜性，已广泛应用于食品、医疗和化学工业[4]。壳聚糖是一种广谱型抗菌剂，对几十种真菌和细菌的生长都有明显的抑制作用[5]。

肉桂精油(Cinnamon essential oil，CEO)由桂皮等提取而得，具有明显的抗氧化和抑菌活性，可以作为天然食品防腐保鲜剂用于食品工业[6]。但由于精油的易挥发性，在应用过程中容易受环境影响，导致精油有效成分流失。因此研制包埋的缓释型精油保鲜剂对食品保鲜意义重大，目前将精油与具备抑菌潜能的缓释基质壳聚糖粒子或壳聚糖纳米粒子结合逐渐成为微生物控制方面新的发展趋势[7-8]。本试验以壳聚糖纳米粒为载体包埋肉桂精油，以包封率为指标，研究了影响壳聚糖包埋肉桂精油形成纳米粒的因素，并探究了最优工艺下制备的肉桂精油壳聚糖纳米粒(CEO-CS-NPs)的表征、缓释性能及对冷却肉的保鲜作用，以期为冷却肉保鲜研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂肉桂精油(纯度90%)，郑州麦雪龙食品香料有限公司生产；壳聚糖(中等分子量，脱乙酰度≥90%)，上海阿拉丁试剂有限公司生产；新鲜猪肉，购自陕西杨凌好又多超市。试剂包括冰醋酸(HAc，分析纯)、三聚磷酸钠(TPP，分析纯)、吐温-80(AR，分析纯)、无水乙醇、95%乙醇、二氯甲烷、蒸馏水和超纯水。

1.1.2仪器与设备78-1型磁力加热搅拌器，上海浦东物理化学仪器厂；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；LGJ-10D真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；UV-1700紫外可见分光光度计，SHIMAPZU CORPORATION；pHS-3C精密pH计，上海日岛科学仪器有限公司；HANGPINGJA2003天平(感量100～0.000 1 g)，上海天平仪器厂；HT7700透射电子显微镜，日立高新技术公司；S4800扫描电镜，日本日立公司；WSC-S测色色差计，上海精密科学仪器有限公司；超净工作台，富康空气净化公司；智能恒温恒湿培养箱，宁波海曙赛福试验仪器厂；灭菌锅，上海博讯实业有限公司；WG-43鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司。

1.1.3培养基采用营养琼脂培养基。1 L煮沸并冷却的蒸馏水中加入胰蛋白胨5 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15 g，pH调至7.0，加NaCl 8.5 g，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2肉桂精油壳聚糖纳米粒(CEO-CS-NPs)的制备与检测

1.2.1制备参照 Calvo等[9]和Hosseini等[10]的方法并加以改进，利用离子凝胶结合O/W乳液的方法制备肉桂精油壳聚糖纳米粒。称取CS粉末，20 ℃下溶于体积分数1%的HAc溶液中，1 μm 微孔滤膜过滤，用5 mol/L NaOH 调pH为4，加入吐温-80(亲水亲油指数(HLB)15.9)至其体积分数为1%，60 ℃加热2 h，制得5.0 mg/mL的CS溶液。将交联剂TPP溶于超纯水，用0.45 μm微孔滤膜过滤，配成1.5 mg/mL的TPP溶液。称取肉桂精油，溶于适量的二氯甲烷中，得油相，然后缓慢逐滴将其加入到水相CS溶液中，使肉桂精油质量浓度为0.5 mg/mL(以CS溶液体积计算)，20 ℃温和搅拌(300 r/min)30 min，得O/W乳液。然后逐滴加入TPP溶液至CS与TPP溶液体积比为2∶1，滴加速度为2滴/秒，同前条件搅拌乳液30 min，所得乳白色悬液即为肉桂精油壳聚糖纳米粒(CEO-CS-NPs)，离心(12 000 r/min)15 min，取下层，蒸馏水冲洗，-40 ℃真空冷冻干燥备用。用相同的制备方法，向CS 溶液中滴加TPP 溶液，但不加入肉桂精油，制得CS/TPP微粒(CS-NPs)，作为空白对照。

1.2.2包封率(Encapsulation effeciency，EE)检测将制备的CEO-CS-NPs悬液用超滤器(超滤膜Mr 截留值为10 000)在12 000 r/min条件下离心30 min，取截留的CEO-CS-NPs颗粒，加入等体积的2 mol/L盐酸溶液破碎纳米粒，用体积分数95%乙醇溶解定容至10 mL容量瓶中。用紫外分光光度计在275 nm处测定吸光度，根据标准曲线确定肉桂精油的质量浓度，计算包封率(EE)。以相同方法制备的破碎的CS-NPs为对照。

EE(%)=(m2/m1)×100%。

式中：m1为制备纳米粒加入的总的肉桂精油的量，m2为包埋在纳米粒中的肉桂精油的量。

1.2.3透射电镜观察取上述制备的CEO-CS-NPs溶液，用体积分数1%的醋酸溶液稀释10倍后取1滴，用质量分数2% 的磷钨酸(PTA)复染后置于铜网上，自然干燥，最后用透射电镜观察粒子的形态、数量及大小。

1.2.4扫描电镜观察将CEO-CS-NPs和CS-NPs粉末分别均匀置于云母片上，固定后喷金。用扫描电镜(电压5 kV)观察其形态和大小。

1.3CEO-CS-NPs对冷却肉的保鲜效果

1.3.1肉样的处理将购买的新鲜猪肉于4 ℃冰箱中储藏24 h以充分排酸并使中心温度降至4 ℃后分割成规则小块，准确称取肉样数份，每份100 g，分别浸入100 mL保鲜剂中处理约30 s，取出沥干，用聚乙烯保鲜膜包好置于聚苯烯托盘放于(4±0.5) ℃冰箱中储藏待测。试验设计见表1。根据预试验结果，本研究选用质量分数0.2%和1.0%的CEO添加量进行试验。

表 1　肉桂精油壳聚糖纳米粒保鲜效果试验设计

注：括号中的数据为CEO的质量分数。

Note：Data in parentheses are the mass fractions of CEO.

1.3.2测定指标与方法分别于储藏2，4，6，8，10和12 d取样测定肉样的色泽、TBARS值，在储藏1，3，5，7，9 d取样测pH，在储藏1，3，5，7，9和11 d取样测菌落总数。

(1)色泽。用WSC-S测色色差计测定肉样色泽，用白板对设备进行校准，测定指标为L值、a*值和b*值。L值表示样品的亮度，a*值表示肉样的红色度，b*值表示肉样的黄度。每组肉样随机取2个点测定，每个点重复测定3次，结果取平均值。

(2) TBARS值。TBARS 值以每千克肉样品中丙二醛的毫克数表示。取10 g待测肉样研细，置于三角瓶中，加入50 mL体积分数7.5%的三氯乙酸溶液(含体积分数0.1%的EDTA)，振荡摇匀30 min，用双层滤纸过滤。取5 mL滤液，加入5 mL 0.02 mol/L 的2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴40 min，冷却1 h后，1 600 r/min 离心5 min，取上清液，准确加入5 mL氯仿，摇匀，静置分层后取上清液，分别在532和600 nm处测吸光值OD532、OD600，计算TBARS(单位：mg/kg)。

(3)pH。用PHS-3C型精密pH计测肉样pH值。取待测肉样10 g，剪碎后加入煮沸并冷却的双蒸水90 mL，振荡20 min，双层纱布过滤，用pH计测过滤液pH值，重复测3次，结果取均值。

(4) 菌落总数。菌落总数按GB4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检测 菌落总数测定》[11]中的琼脂平板计数法进行测定。

1.4统计分析

数据用Excel 2007和Minitab 16.0统计软件进行分析，采用ANOVA分析各处理间的差异显著性。

2结果与分析

2.1肉桂精油壳聚糖纳米粒的表征

2.1.1包封率在壳聚糖质量浓度5.0 mg/mL、TPP质量浓度1.5 mg/mL、肉桂精油0.5 mg/mL、pH为4.0的条件下，制得的悬液呈乳白色，包封率为(37.5±2.1)%。

2.1.2透射电镜(TEM)观察通过透射电镜对纳米粒进行表征分析，结果显示，CEO-CS-NPs呈球形，粒径较为均匀，形态饱满，大小约为180 nm(图1-a)，空白纳米粒CS-NPs同样呈球形，形态规则(图1-b)。

图 1CEO-CS-NPs(a)和CS-NPs(b)的透射电镜图

Fig.1TEM micrograph of CEO-CS-NPs (a) and CS-NPs(b)2.1.3扫描电镜(SEM)观察图2 结果显示，CEO-CS-NPs和CS-NPs冻干后，仍呈球形颗粒，颗粒大小较为均匀。

图 2　CEO-CS-NPs(a)和CS-NPs(b)的SEM图

色泽能在一定程度上反映出肉的新鲜度和健康状况，并与消费者的购买意愿直接关联[12]。由表2可以看出，随着储藏期的延长，各处理L值减小，即冷却肉亮度下降；在储藏后期，对照组L值下降较大，颜色较浅，缺乏光亮。试验第4，8，10和12天，处理ⅣL值显著高于其他处理组(P<0.05)，较其他处理组光亮度好；第6天，处理ⅣL值低于处理Ⅲ，但仍显著高于其他处理(P<0.05)。试验期内，Ⅲ、Ⅳ处理的L值分别显著高于Ⅰ、Ⅱ处理(P<0.05)，分析原因为肉桂精油包埋后能减少精油的挥发损失，使其保鲜作用得以延长。

表 2　保鲜剂处理的冷却肉在储藏期内色泽的变化

续表 2　Continued table 2

注：CK2代表对照组储藏2 d 处理，其他处理代号依此类推；同一储藏时间同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：CK2 represents control group stored for 2 days,other treatments are similar.Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) between storage times.

由表2可知，试验第2，4，6，8和12天，各处理组a*值显著高于对照组(P<0.05)，第10天除了处理Ⅰ外其他处理也均显著高于对照组；试验第6～12 天，含1.0%CEO的处理Ⅱ和Ⅳ的a*值显著高于不含精油的处理Ⅴ和Ⅵ(P<0.05)，这可能是受肉桂精油本身颜色的影响。第12天，含1.0%CEO的处理Ⅳa*值为11.07，显著高于其他处理(P<0.05)，说明在储藏后期该处理可以良好地保持肉的红度。

表2结果显示，随着储藏期的延长，各处理b*值总趋势为增加；6～12 d，对照组b*值显著高于其他处理(P<0.05)；第12天，处理Ⅳb*值为9.87，显著低于其他处理(P<0.05)，效果最好。

2.3CEO-CS-NPs对冷却肉TBARS值的影响

TBARS值是评价脂质氧化程度的一个指标[13-14]。一般当冷却肉的TBARS值大于0.5 mg/kg时，会有氧化异味产生。由图3可知，从储藏的第6天开始，各处理TBARS值显著低于对照组(P<0.05)，说明各保鲜剂处理均可在一定程度上控抑脂肪氧化；Ⅲ、Ⅳ处理的TBARS值分别显著低于处理Ⅰ、Ⅱ，说明肉桂精油被壳聚糖包埋后，其抗氧化作用大于游离的精油，该结果与包埋酚类物质用于面粉抗氧化的研究结果[15]具有一致性；随着CEO含量的增加，TBARS值增幅减小，但由预试验得知，如果继续增加精油含量，会有明显的精油味道，因此CEO对肉感官品质的影响好坏还有待进一步研究，所以不建议继续增大肉桂精油的含量；处理Ⅳ的TBARS值极显著低于其他各处理(P<0.01)，说明在本试验条件下，处理Ⅳ控制脂肪氧化的效果最佳。处理Ⅳ储藏前6天的TBARS值始终不超过 0.5 mg/kg，而对照组在储藏3 d后即超过0.5 mg/kg。

图 3　CEO-CS-NPs对冷却肉TBARS的影响

2.4CEO-CS-NPs对冷却肉pH的影响

肉的新鲜程度与pH值的关系复杂，pH值在一定程度上能反应出肉的新鲜度，通常新鲜肉pH为5.8～6.2，次鲜肉pH为6.3～6.6，变质肉pH在6.7以上。由图4可知，在储藏的前7 d，处理Ⅲ和Ⅳ 的pH相对稳定，变化幅度小，符合新鲜肉的pH标准，而其他组pH变化幅度较大；从第7天开始，处理Ⅳ pH值显著低于处理Ⅲ(P<0.05)，表现最佳，说明随着CEO含量的增加，其对肉的保鲜效果增强。

2.5CEO-CS-NPs对冷却肉菌落总数的影响

图5显示，各试验组在贮藏前3 d的菌落总数上升缓慢，对照组与其他处理组之间差异不显著(P>0.05)；3 d后，菌落总数增长速度明显加快，其中对照组增长最快，但处理Ⅲ与处理Ⅳ的菌落总数增长相对较慢，显著低于无CEO的处理Ⅴ和Ⅵ(P<0.05)；贮藏至9 d后，处理Ⅱ和Ⅳ的菌落总数分别显著低于处理Ⅰ和Ⅲ(P<0.05)，说明随着CEO含量的增加，其抑菌效果增强；储藏7 d后，处理Ⅳ的菌落总数始终处于最低水平，抑菌效果最好。空白纳米粒处理Ⅴ和Ⅵ的菌落总数增长较快的原因可能是，空白纳米粒溶液处理有水分，使样品表面保持湿润状态，而高湿条件有利于微生物的生长。

图 4　CEO-CS-NPs对冷却肉pH值的影响

图 5　CEO-CS-NPs对冷却肉菌落总数的影响

3讨论与结论

本试验中，肉桂精油经过壳聚糖包埋后，有效地克服了其易挥发的缺点；同时，因其具有缓释作用，有效地延长了肉桂精油的保鲜作用时间，这与包埋山梨酸用于香肠保鲜的结果[16]具有一致性。肉桂精油壳聚糖纳米粒对冷却肉的保鲜机制为：纳米粒表面吸附的肉桂精油因其可以快速从体系中解析出来而先发挥作用；而纳米粒内部的肉桂精油因纳米粒需吸胀、溶解、解吸后肉桂精油才能被释放[17]，所以发挥保鲜作用的时间可以得到有效延长。本试验中不同批次制备的纳米粒存在一定差异，可见条件的控制还不够完善，若要将其应用到实际生产中，还需要进一步的研究。肉桂精油壳聚糖纳米粒作为一种新型的抑菌体系，可进一步研究其与其他保鲜处理(如气调等)相结合使用后的效果，以更好地发挥其保鲜作用。

本试验制备了肉桂精油壳聚糖纳米粒(CEO-CS-NPs)，并研究了其对冷却猪肉储藏期间理化指标和微生物指标的影响。由试验结果可知，制备的纳米粒颗粒饱满，大小均一，冻干后颗粒大小仍较为均匀，包封率为(37.5±2.1)%。包埋肉桂精油的CEO-CS-NPs能有效保护肉品色泽，抑制冷却肉表面细菌的增长，其中以包埋质量分数1.0%CEO的CEO-CS-NPs效果最好，具有改善肉贮藏品质的作用。通过分析肉样的L值、a*值、TBARS、pH及菌落总数等指标得出，CEO-CS-NPs对冷却肉保藏的有效性表现为：随着包埋的CEO质量分数增加到1.0%，其在色泽和菌落总数指标上的表现优于其他试验组。包埋质量分数0.2%CEO的CEO-CS-NPs的效果略弱于包埋质量分数1.0%CEO的CEO-CS-NPs。综合理化指标和微生物指标(特别是TBARS值)得出，经包埋质量分数1.0%CEO的CEO-CS-NPs处理的冷却猪肉，在(4±0.5) ℃条件下储藏时保存时间可达到6 d，明显优于对照组3 d的储藏期。

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Application of cinnamon essential oil loaded chitosan nanoparticles in chilled meat preservation

LIU Zhan-dong,LI Lu,QUAN Guo-fen,DING Wu

(CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study used cinnamon essential oil (CEO) loaded chitosan nanoparticles to expand its application in preservation of chilled meat by overcoming its volatility.【Method】 The CEO loaded chitosan nanoparticles were prepared using ionic gelation process.Then they were characterized by TEM and SEM and encapsulation efficiency was measure.Preservatives of CEO loaded chitosan nanoparticles with mass fractions of 3% and 6% (CEO mass fractions were 0.2% and 1.0%) were prepared.Chilled pork was then processed with preservatives,and color (L value,a* value,b* value),TBARS value,pH and total number of colonies were detected.【Result】 CEO loaded chitosan nanoparticles had a spherical and plump shape with uniform particle size after freeze-drying.The encapsulation efficiency (EE) was (37.5±2.1)%.Based on the analysis of color,TBARS,pH and total number of colonies of chilled meat,preservation of chilled meat by 1% CEO loaded chitosan nanoparticles reached 6 days at (4±0.5) ℃.【Conclusion】 The CEO loaded chitosan nanoparticles had good characterization and can extend the preservation of chilled meat.

Key words：cinnamon essential oil;chitosan;nanoparticles;chilled meat

DOI：网络出版时间:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.026

[收稿日期]2014-09-26

[基金项目]陕西省自然科学基金项目(K33202096)

[作者简介]刘占东(1990-)，男，吉林松原人，在读硕士，主要从事畜产食品深加工与安全控制研究。E-mail:454061077@qq.comE-mail:dingwu10142000@hotmail.com

[通信作者]丁武(1971-)，男，陕西吴堡人，教授，博士生导师，主要从事畜产食品深加工与安全控制研究。

[中图分类号]TS205.7

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)05-0193-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.052.html