艾灸对克罗恩大鼠结肠RoRγt、Foxp3调节作用研究＊

王硕硕，包春辉，王伟灵，戴 明，吴焕淦，王晓梅，翁志军，刘慧荣，胡智海＊

（1.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院 上海 200082；2. 上海中医药大学上海市针灸经络研究所 上海 200030；3. 上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

艾灸对克罗恩大鼠结肠RoRγt、Foxp3调节作用研究＊

王硕硕1＊＊，包春辉2＊＊，王伟灵1，戴 明3，吴焕淦2，王晓梅2，翁志军2，刘慧荣2，胡智海1＊＊＊

（1.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院 上海 200082；2. 上海中医药大学上海市针灸经络研究所 上海 200030；3. 上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

目的：观察隔药灸对克罗恩大鼠结肠Th17特异性转录因子维甲酸相关孤核受体γt（RoRγt）和Treg特异性转录因子叉头蛋白P3（Foxp3）的表达调节作用，探讨灸法治疗克罗恩病的可能效应机制。方法：SPF级雄性SD大鼠40只，完全随机分为4组，每组10只：正常组、模型组、隔药灸组和西药组（美沙拉嗪），采用三硝基苯磺酸（TNBS）溶液灌肠制备大鼠克罗恩疾病模型，隔药灸组取穴：天枢（双）、气海穴，西药组：美沙拉嗪灌胃治疗。治疗干预结束后，采用HE病理染色、免疫组织化学和Real-time PCR方法观察大鼠结肠降部组织病理学变化、Foxp3 mRNA的表达情况。结果：模型大鼠结肠组织出现克罗恩病的典型病理表现：裂隙状溃疡、黏膜层炎症伴肉芽肿，Th17特异性转录因子RoRγt蛋白在模型大鼠结肠黏膜及黏膜下层表达高于正常组大鼠（P＜0.01），隔药灸和美沙拉嗪对RoRγt蛋白具有下调作用（P＜0.01），且美沙拉嗪的调节作用强于隔药灸（P＜0.01）；Treg细胞特异性转录因子Foxp3及其mRNA在模型大鼠结肠黏膜及黏膜下层表达均低于正常组大鼠（P＜0.01），隔药灸和美沙拉嗪对Foxp3及其mRNA都具有上调作用（P＜0.01），但两组间比较无统计学差异（P＞0.01）。结论：隔药灸可能通过调节克罗恩病模型大鼠结肠黏膜Th17/Treg细胞平衡中特异性转录因子RoRγt、Foxp3的表达来发挥改善结肠组织溃疡，缓解肠道炎症的治疗作用。

克罗恩病 隔药灸 RoRγt Foxp3

克罗恩病（Crohn’s Disease，CD）属慢性非特异性肠道炎症性疾病，目前病因尚不十分清楚的，临床症见腹痛、腹泻、肠梗阻，伴有发热、营养障碍等肠外表现，具有慢性和消耗性的特征，病程多迁延难愈，近年发病率逐年升高[1]。目前，临床应用较多的药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、炎性介质抑制剂、靶向生物免疫治疗、抗生素等[2]。长久服用药物存在不良反应和手术术后复发率的难点。中医针灸治疗 克罗恩样肠腑病症具有悠久的历史，现代临床研究也证实针灸治疗轻中型CD的疗效确切，可显著改善CD患者的全身症状，如减少腹泻次数、降低CD活动指数[3-5]，值得进一步临床推广应用和对其效应机制的深入研究。

Thl7细胞和Treg细胞在IBD的关系中日益受到重视，二者存在相互转化现象。目前，恢复体内的Thl7/Treg平衡对动物模型和IBD患者的疗效不断得到验证[6]。这些研究都补充了 Thl/Th2免疫介导的不足，揭示Thl/Th2亚群失衡并不能说明它们在疾病中起绝对作用。多种疗法进一步的研究证实，ThI7/Treg转化平衡是维持肠道免疫稳态的重要因素，这可能成为人类导致IBD的原因之一[7]。维甲酸相关孤核受体γt（Retinoid-related Orphannuclear Receptor γt，RORγt）是Thl7细胞特异性转录因子，参与自身免疫性疾病、感染和肿瘤等多种病理过程，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义[8]。Treg依赖特异性转录因子叉头蛋白P3 （FoxP3）以维持稳定表达，释放IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子来抑制自身反应性T细胞的增殖活化，维持自身免疫耐受[9]。CD4+T细胞的亚群各自发挥不同的功能，并相互制约并且在一定的条件下可以互相转化[10]。Thl7和Treg细胞各自在调控免疫反应中发挥了不同的作用。它们参与了免疫炎症级联反应中抗原的识别，细胞信号通路的激活，炎症效应的放大，下游炎性因子的释放等诸多环节。因此，干预其中任何一个必要环节都可能起到缓解病情的作用[11]。为此，本研究制作CD大鼠模型，从Th17特异性转录因子RoRγt和Treg特异性转录因子Foxp3及其mRNA的调节作用角度，来观察隔药灸对CD大鼠的治疗效果，为灸法治疗CD效应机制的阐明提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及模型制备

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量140±10 g，由上海中医药大学动物实验中心提供。实验室内温度20±2℃，相对湿度60±10%，自由饮食饮水，模型制作成功后完全随机分组为4组，每组10只：正常组、模型组、隔药灸组、美沙拉嗪组。参照国际公认Morris法[12]制作CD大鼠模型，即TNBS合乙醇溶液灌肠。实验前禁食不禁水24 h，1%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）腹腔麻醉，将5%（W/V）的TNBS与50%乙醇按2:1体积比混合成灌肠液，按照3 mL·kg-1体重，于距肛门6-8 cm处注入灌肠液，1次/周，共4次。

1.2 分组与治疗

隔药灸组取穴：天枢（双）、气海，穴位定位参照普通高等教育“十五”国家级规划教材《实验针灸学》[13]。药饼配方：将附子、肉桂、丹参、黄连等药材研末后加适量黄酒调和，用模具制成直径0.5 cm、厚0.3 cm大小，上置约90 mg小艾炷施灸，每次每穴各灸2壮，每日1次，连续治疗10天。美沙拉嗪组：采用美沙拉嗪溶液灌胃。每日投药量：根据《药理学实验方法》，按成人（70 kg体重）与大鼠（200 g体重）1:0.018比例配制美沙拉嗪溶液，每日2次投药，共灌胃10天。

1.3 实验试剂和仪器

三硝基苯磺酸TNBS（美国Sigma公司，批号：Q1894）；兔抗大鼠RoRγt、Foxp3 一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司，批号：SC-28705）；EnVision二抗试剂盒（上海基因科技公司，批号：GK500710）；逆转录酶反应体系（上海基尔顿生物科技有限公司）；美沙拉秦肠溶片（德国Losan Pharma GmbH 公司，批号：C1420018878）。

1.4 指标检测

1.4.1 结肠组织病理学观察

经HE染色后，在光学显微镜下观察各组大鼠结肠组织病理学变化。

1.4.2 结肠组织RoRγt、Foxp3表达的测定

采用Envision法检测，石蜡切片进行柠檬酸缓冲液微波加热抗原修复；0.01 mol·L-1PBS冲洗5 min×3次；0.3%H2O2灭活内源性过氧化物酶；0.01 mol·L-1PBS冲洗5 min×3次；滴加兔抗鼠RoRγt（1:500）、Foxp3（1:1 000）一抗，37℃孵育2 h，0.01 mol·L-1PBS冲洗5min×3次；滴加山羊抗兔二抗，室温孵育30 min；0.01 mol·L-1PBS冲洗5 min× 3次；滴加DAB显色液（EnVision试剂盒，上海基因科技公司），显微镜下控制显色时间；采用Motic图像分析系统分析阳性目标 平均积分光密度（Integral Optical Density，IOD）。

1.5 Real-time PCR技术检测大鼠结肠Foxp3 的mRNA表达

从结肠组织中提取总RNA，用逆转录酶反应体系合成cDNA，相对基因表达量由CT法来控制。以GAPDH为内参照，Foxp3引物由Primer Express设计合成。FoxP3-mRNA的Sense：5’-GAGAAAG TGGCAGGGAAGGAGT-3’和Antisense：5’-TCTGAGGCAGGCTGGATAACG-3’。

1.6 统计分析法

实验数据均采用统计学软件SPSS 18.0进行统计分析，实验数据有表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法进行多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠结肠组织病理学变化（HE染色）

正常组大鼠结肠结构完整，未见水肿或增生，肠壁肌层、浆膜层完整。模型组结肠黏膜面溃疡，局部黏膜上皮缺失，裂隙状溃疡形成，固有层间质、黏膜下层结缔组织水肿，大量嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润等炎症病理表现，符合克罗恩病结肠病理学表现。经隔药灸治疗后，结肠组织可见溃疡愈合，充血水肿程度减轻，黏膜固有层增厚，杯状细胞增生。经美沙拉嗪治疗后，结肠组织也呈现出同隔药灸治疗组类似的改善。这说明隔药灸同美沙拉嗪能够缓解和改善CD大鼠结肠组织的形态结构的改变及炎症程度，各组大鼠结肠病理染色如下图1所示。

图1 大鼠结肠组织病理学变化

2.2 结肠组织RoRγt、Foxp3表达情况

由实验结果可知，正常组大鼠肠黏膜上皮细胞及粘膜固有层单个核细胞胞浆中均可见RoRγt蛋白的表达；与正常组相比，模型组肠黏膜上皮细胞胞质、淋巴细胞RoRγt蛋白表达增强（P＜0.01）；经过隔药灸和美沙拉嗪治疗后，RoRγt蛋白在上述大鼠肠黏膜部位的表达减弱（P＜0.01），与隔药灸组相比，美沙拉嗪组的下调作用更为明显（P＜0.01），如图2所示。

正常组大鼠肠黏膜上皮、黏膜间质内淋巴细胞Foxp3蛋白均有表达；与正常组相比，模型组大鼠肠黏膜上皮细胞、腺上皮细胞Foxp3蛋白表达减弱（P＜0.01）；隔药灸和美沙拉嗪能够上调Foxp3在上述部位的表达（P＜0.01），如图3所示。

2.3 结肠组织RoRγt、Foxp3 的mRNA表达

模型组大鼠结肠组织Foxp3 mRNA表达量低于正常组大鼠（P＜0.01），隔药灸组Foxp3 mRNA表达较模型组明显上调（P＜0.01），美沙拉嗪也能够上调CD大鼠结肠Foxp3 mRNA的表达，调节作用强于隔药灸组，差异有统计学意义（P＜0.01），如图4所示。

图2 各组大鼠结肠组织RoRγt蛋白表达

图3 各组大鼠结肠组织Foxp3蛋白表达

3 讨论

灸法在现代临床中治疗克罗恩病具有很好的疗效[14]，尤其在临床症状的改善、病情活动的维持缓解以及防治并发症等方面，与现代医学疗法相比具有一定优势，可以作为辅助疗法用于轻、中度活动期克罗恩病的治疗，且操作简便无副作用，本课题组长期从事针灸治疗克罗恩病的临床与基础研究工作，作者在临床有效的基础上，采用目前国际公认的TNBS灌肠法制备实验性CD大鼠模型，开展针灸治疗CD的作用机制研究。

图4 各组大鼠结肠组织Foxp3 mRNA表达

以往实验已经证实，针灸在调节Thl/Th2细胞平衡紊乱方面存在调节作用[15，16]，Thl7细胞和Treg细胞在IBD的关系中日益受到重视，二者存在相互转化关系。目前，恢复体内的Thl7/Treg平衡对动物模型和IBD患者的疗效均已得到不断的验证[6]。初始CD4+T细胞周围TGF-β浓度较低且存在IL-16时，TGF-β能诱导RORγt的产生，促使初始CD4+T分化为Thl7细胞[17]，同时抑制FoxP3+Treg细胞的产生。而TGF-β浓度较高时，可上调FoxP3的表达，并抑制RORγt的产生，从而阻止初始CD4+T分化为Thl7细胞。这说明细胞因子调节的RORγt/FoxP3平衡决定了初始CD4+T受抗原刺激后向Thl7细胞或Treg方向分化。

本研究检测了各组大鼠结肠组织中与Th17细胞分化发育具有关键作用的转录因子RORγt。结果显示，采用TNBS灌肠方法刺激大鼠，与正常组大鼠相比，模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞RORγt蛋白表达升高，结合结肠炎症的病理表现，说明RORγt蛋白表达增加可能增强了黏膜局部幼稚T细胞向Th17细胞分化这一过程而促进炎症反应，当用隔药灸和美沙拉嗪干预后，使得结肠黏膜RORγt蛋白表达出现下调，说明在这个过程中隔药灸可能通过下调RORγt蛋白的表达来发挥抗炎的作用。作者对具有抗炎作用的Treg细胞特异性转录因子FoxP3及其mRNA检测后发现，与正常组大鼠相比，模型组大鼠肠黏膜上皮、黏膜间质内淋巴细胞、单核/巨噬细胞胞质FoxP3表达降低，结合模型组大鼠结肠炎症病理表现，说明转录因子FoxP3蛋白的降低可能使得Treg细胞分化受阻而导致炎症的增强，经过隔药灸和美沙拉嗪治疗后，结肠黏膜FoxP3的表达出现上调。同时，结肠炎症减轻，对结肠FoxP3 mRNA的检测结果也显示出类似的变化趋势，这说明Treg细胞转录因子FoxP3在TNBS诱导的结肠炎症过程中发挥了抗炎作用。以上结果说明，Thl7细胞和Treg细胞中的RoRγt、Foxp3在隔药灸治疗CD的效应机制中也发挥了重要作用。

1 Cosnes J, Gower-Rousseau C, Seksik P,et al. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases.Gastroenterology, 2011, 140(6): 1785-1794.

2 Salas A, Panés J. IBD.Regulatory T cells for treatment of Crohn’s disease.Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2015, 12(6): 315-316.

3 包春辉.不同针灸疗法治疗克罗恩病的临床效应观察及中枢响应特征研究.上海:上海中医药大学博士论文, 2014: 1-5.

4 施茵,包春辉,吴焕淦,等.隔药灸结合针刺对克罗恩病患者肠黏膜TNF-α、TNFR1、TNFR2 表达及肠上皮细胞凋亡的影响.上海中医药杂志, 2011, 45( 1): 46-50．

5 包春辉,施茵,马晓芃,等.克罗恩病的发病机制及针灸治疗进展与思考.上海针灸杂志, 2010, 29( 11): 681-686．

6 Ogino H, Nakamura K, Ihara E,et al.CD4+CD25+regulatory T cells suppress Th17-responses in an experimental colitis model.Dig Dis Sci, 2011, 56(2): 376-386.

7 Xu J, Yang Y, Qiu Q,et al. Stat4 Is Critical for the Balance between Thl7 Cells and Regulatory T Cells in Colitis.J Immunol, 2011, 186(11): 6597-6606.

8 Harrington L E, Hatton R D, Mangan P R,et al. Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.Nat Immunol, 2005, 6(11): 1123-1132.

9 Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.Science, 2003, 299(5609): 1057-1061.

10 Ueno A, Jijon H, Chan R,et al.Increased prevalence of circulating novel IL-17 secreting Foxp3 expressing CD4+T cells and defective suppressive function of circulating Foxp3+ regulatory cells supportplasticity between Th17 and regulatory T cells in inflammatory bowel disease patients.Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(12): 2522-2534.

11 Fitzpatrick L R. Inhibition of IL-17 as a pharmacological approach for IBD.Int Rev Immunol, 2013, 32(5-6): 544-555.

12 李忠仁.实验针灸学.北京:中国中医药出版社, 2003: 251.

13 Morris G P, Beck P L, Herridge M S,et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology, 1989, 96(3): 795-803.

14 Bao C H, Zhao J M, Liu H R,et al. Randomized controlled trial: moxibustion and acupuncture for the treatment of Crohn’s disease.World J Gastroenterol, 2014, 20(31): 11000-11011.

15 马晓芃,安彩萍,吴焕淦,等.隔药灸与电针对克罗恩病大鼠结肠IGF-I、IGF-I R、IGF-BP5 表达的影响.上海针灸杂志, 2008, 27(5): 37-40．

16 Zhao C, Ding J Y, Ma J D,et al．Acupuncture on the Basic Fibroblast Growth Factor and Type I Collagen in Colons of rats with Crohn’s Diseas.J Acupunct Tuina Sci, 2011, 9(1): 1-6．

17 Ivanov I I, McKenzie B S, Zhou L,et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells.Cell, 2006, 126(6): 1121-1133.

Study on Regulation Function of Moxibustion on Expressions of RoRγt and Foxp3 in Colon of Rats with Crohn Disease

Wang Shuoshuo1, Bao Chunhui2, Wang Weiling1, Dai Ming3, Wu Huangan2, Wang Xiaomei2, Weng Zhijun2, Liu Huirong2, Hu Zhihai1
(1. Shanghai TCM Integrated West Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200082, China; 2. Shanghai Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai University of TCM, Shanghai 200030, China; 3. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032, China)

This study was aimed to observe the regulation function of herbs-partition moxibustion on the expressions of RoRγt and Foxp3 in the colon of rats with crohn disease (CD), and to explore the mechanism of moxibustion in the treatment of CD. A total of 40 male SD rats of specific pathogen free grade were randomized into the normal group, the model group, the herbs-partition moxibustion group and the west medicine group (mesalazine), with 10 rats in each group. Trinitro-benzene-sulfonic acid (TNBS) was used to develop CD models.Tianshu(ST25, both sides) andQihai(RE6) were selected in herbs-partition moxibustion group. In the west medicine group, rats

mesalazine by gavage. At the end of the intervention, histopathological changes and Foxp3 mRNA expression in rats’ descending colon were detected by using HE pathological dyeing, immunohistochemistry and real-time PCR. The results showed that colon tissues of rats in the model group expressed typical pathologic signs of CD: crack ulcer and mucosa inflammatory granuloma. The protein expression of RoRγt in the model rat colonic mucosa and submucosa was higher than that of the normal group (P＜ 0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can decrease the protein expression of RoRγt (P＜0.01). The regulation function of mesalazine was stronger than that of herbs-partition moxibustion (P＜0.01). The protein expression of Foxp3 and mRNA in the model rat colonic mucosa and submucosa was lower than that of the normal group (P＜0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can lift the protein expression of Foxp3 and mRNA (P＜0.01), but there was no statistical difference between two groups (P＞0.01). It was concluded that the possibly mechanisms of herbs-partition moxibustion to improve the colon tissue ulcers and alleviate the intestinal inflammation were through the regulation on the expression of RoRγt and Foxp3 in the CD model rat colonic mucosa Th17/Treg cell.

Crohn disease, herbs-partition moxibustion, RoRγt, Foxp3

10.11842/wst.2016.03.007

R245

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 科学技术部国家重点基础研究发展计划“973计划”项目（2015CB554501）：艾灸效应的启动机制及其内源性调节作用的机理研究，负责人：吴焕淦；教育部新世纪优秀人才计划项目（NCET-13-0907）：针灸治疗克罗恩病临床与基础研究，负责人：刘慧荣；上海市科委自然科学基金基础研究项目（13ZR1439400）：艾灸对克罗恩病肠道免疫稳态失衡及脑肠神经信息的调节机制研究，负责人：刘慧荣；上海中医药大学上海市重点学科资助项目（S30304-A17）：艾灸对克罗恩病大鼠肠神经系统的调节机制研究，负责人：王晓梅。

＊＊ 王硕硕和包春辉为并列第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：胡智海，副主任医师，硕士生导师，主要研究方向：针灸干预胰岛素抵抗研究。